孫明霞，蔣鵬程，于峰，劉彩霞，范桂蓮，張輝

目前人類乳頭瘤病毒（HPV）檢測是宮頸癌的主要篩查方式，但其準確性不高。在宮頸癌篩查中，經陰道彩色多普勒超聲（TVCDS）、血清學指標檢查是常用的檢查方法。但是如何將以上檢查有機結合從而提高對宮頸癌的診斷準確性的研究目前仍然較少。本研究探索了TVCDS 聯(lián)合血清miRNA-18a、miRNA-92a 診斷宮頸癌的價值，發(fā)現(xiàn)其對宮頸癌具較高的診斷效能，可提高宮頸癌的早期診斷率，值得臨床推廣使用，為臨床無創(chuàng)診斷宮頸癌提供了理論依據。

宮頸癌（CC）是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤，在我國其發(fā)病率逐年上升［1-2］。人類乳頭瘤病毒（HPV）檢測是現(xiàn)在主要的CC 篩查方式［3］，但其特異度和陽性預測值較低［4-5］；脫落細胞學和病理學檢查雖然特異度高，但對檢查技術要求較高，無法重復檢測。無創(chuàng)檢查中，經陰道彩色多普勒超聲（TVCDS）不僅可得到子宮腫瘤的位置和大小，還可以獲取其供血狀態(tài)［6］，但其診斷主要依賴專業(yè)經驗，靈敏度和特異度均不高。血清學指標是診斷多種疾病簡易有效的方式，但卻沒有特定的CC 血清學指標應用于臨床中。既往研究顯示，miRNA-18a 和miRNA-92a 在包括CC 在內的多種癌癥患者的血清中水平升高［7-8］，但關于其是否可作為CC血清學檢測指標的研究仍然較少。為此，本研究探索TVCDS 聯(lián)合血清miRNA-18a、miRNA-92a 診斷CC 的價值，以期為臨床無創(chuàng)診斷CC 提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2015 年3 月—2017 年7 月首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院西區(qū)婦產科經術后病理診斷為CC 的患者122 例為CC 組；選取同期本院病理確診為宮頸上皮內瘤變（CIN）的患者120 例為CIN 組（其中CIN 1～2 級54 例，CIN 3 級66 例）。CC 組 與CIN組納入標準：（1）術后病理診斷明確；（2）術前行TVCDS 和血清miRNA-18a、miRNA-92a 檢測，且臨床資料完整者；（3）精神狀態(tài)良好，生命體征平穩(wěn)，能配合研究者。CC 組與CIN 組排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾病或肝腎功能不全者；（2）術后病理特征不典型者。選擇同期本院確診為子宮良性病變的患者120 例為正常組。正常組納入標準：精神狀態(tài)良好，生命體征平穩(wěn)，能配合研究者。正常組排除標準：伴有明顯的循環(huán)、呼吸和血液等系統(tǒng)疾病的患者。本研究經首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院倫理委員會同意，所有入選患者了解研究意義并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 收集患者一般資料，包括年齡、BMI、高危型人類乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染情況、絕經情況、吸煙情況（每天吸煙1 支以上，連續(xù)或累計6 個月定義為吸煙）、其他性傳播疾病情況。其中HR-HPV 感染情況檢測方法如下：使用基因組DNA 提取試劑盒提取患者DNA，并置于-20 ℃冷藏；后取1～2 μl 樣本，用PCR 試劑盒、PCR 擴增儀進行PCR 擴增；再用雜交試劑盒、醫(yī)用核酸分子快速雜交儀檢測是否有HR-HPV 感染。

1.2.2 TVCDS 檢查 患者排空膀胱后取截石位，使用GE VolusonE8 彩色多普勒超聲診斷儀進行檢查，經陰道容積探頭頻率為5～9 MHz，涂少量耦合劑后套上兩層隔離套，逐漸進入陰道、陰道穹窿部和宮頸處。探頭分別做縱向、斜向、橫向及多方位掃查。觀察宮頸內、外口，宮頸管回聲情況及宮頸是否整齊；再用彩色多普勒血流顯像（CDFI）檢測宮頸部位的血流分布情況，并記錄血流阻力指數（RI）；最后仔細觀察宮體、卵巢及宮旁各組織情況。所有研究對象由同一超聲醫(yī)師采用同一臺超聲儀完成檢查。

1.2.3 血清采集及血清miRNA-18a、miRNA-92a 檢測

采集空腹靜脈血液標本5 ml，加入促凝管，4 ℃條件下4000 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm），再置于4 ℃條件下12000 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），分離血清，分離好的血清暫時置于-80 ℃保存。取100～200 μl 血清，按照miRNeasy Mini Kit 試劑盒（德國QIAGEN 公司）說明書提取血清總RNA；按照All-in-One miRNA qRT-PCR Detection Kit 試劑盒（美國GeneCopoeia 公司）說明書進行RNA 反轉錄，采用qPCR 法檢測血清miRNA-18a、miRNA-92a，以U6 作為內參對照。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；CC影響因素分析采用多因素Logistic 回歸分析；以術后病理診斷結果為金標準，繪制各指標診斷CC 的ROC 曲線，計算ROC 曲線下面積，通過約登指數確定診斷界值，并計算靈敏度、特異度。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較 3 組年齡、BMI、吸煙率、其他性傳播疾病發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；3 組HR-HPV 感染發(fā)生率、絕經發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CIN 組、CC 組HR-HPV 感染發(fā)生率高于正常組，CC 組HR-HPV 感染發(fā)生率高于CIN組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CIN 組絕經發(fā)生率低于正常組、CC組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 TVCDS 檢查結果 宮頸內、外口，宮頸管回聲情況及宮頸是否整齊：CC 組和CIN 組均可見疑似癌變的宮頸異常表現(xiàn)，宮頸體積增大、輪廓改變，表面不光滑、連續(xù)中斷，宮頸邊緣不整，宮頸梭形結構破壞、肌層顯示不清晰，內膜增厚。

宮頸部位的血流分布情況：CC 組CC 腫塊內血管走行復雜錯亂，彩色血流呈“火球”狀或網狀；CIN 組宮頸上皮內病變局部血流較豐富，可見數支棒狀或條狀血管；正常組宮頸內部沒有或只有少許血流信號。

3 組血流RI 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CIN 組、CC 組血流RI 均低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CC 組血流RI 低于CIN 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

宮體、卵巢及宮旁各組織情況：3 組宮體、卵巢及宮旁各組織均為正常生理表現(xiàn)，通過子宮體矢狀斷面，可見宮體呈前位或后位，后位居多；內膜腔隙清晰可見，子宮內膜的回聲與厚度均勻；肌層和漿膜層分別為中等和高強度回聲。半冠狀或半軸狀平面，可見子宮內膜向輸卵管口區(qū)延伸。宮體兩側可見子宮動脈，呈現(xiàn)形態(tài)各異的彩色血流。卵巢實質呈橢圓形低回聲，排卵側被膜下可見多個不均勻分布的小濾泡囊腫。偶見盆腔積液，盆腔積液較多時可見輸卵管。

表13 組患者一般資料比較Table 1 Comparison of baseline data in 3 groups

2.33 組 血 清miRNA-18a、miRNA-92a 比 較 3 組血清miRNA-18a、miRNA-92a 比較，差異有統(tǒng)計學意 義（P＜0.05）；CIN 組、CC 組 血 清miRNA-18a、miRNA-92a 高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CC 組血清miRNA-18a、miRNA-92a 高于CIN 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表3）。

2.4 CC 影響因素的多因素Logistic 回歸分析 以患者是否患CC 為因變量（賦值：是=1，否=0），以年齡（賦值：實測值）、BMI（賦值：實測值）、HR-HPV 感染情況（賦值：有=1，無=0）、絕經情況（賦值：是=1，否=0）、吸煙情況（賦值：是=1，否=0）、其他性傳播疾病情況（賦值：有=1，無=0）、血流RI（賦值：實測值）、血清miRNA-18a（賦值：實測值）、血清miRNA-92a（賦值：實測值）為自變量，進行多因素Logistic 回歸分析，結果顯示，年齡、HR-HPV 感染、絕經、血流RI、血清miRNA-18a、血清miRNA-92a 是CC 發(fā)生的影響因素（P＜0.05，見表4）。

2.5 血流RI、血清miRNA-18a、血清miRNA-92a、血流RI 聯(lián)合血清miRNA-18a、血流RI 聯(lián)合血清miRNA-92a 及 血 流RI 聯(lián) 合 血 清miRNA-18a、miRNA-92a 診 斷CC 的 價 值 血 流RI 診 斷CC 的ROC 曲線下面積為0.844（P＜0.001），診斷界值為0.568，此時靈敏度為80.8%，特異度為68.0%；血清miRNA-18a 診斷CC 的ROC 曲線下面積為0.880（P=0.017），診斷界值為3.175，此時靈敏度為78.7%，特異度為83.7%；血清miRNA-92a 診斷CC的ROC 曲線下面積為0.763（P＜0.001），診斷界值為2.090，此時靈敏度為64.8%，特異度為81.8%；血 流RI 聯(lián) 合 血 清miRNA-18a 診 斷CC 的ROC 曲線 下 面 積 為0.936（P＜0.001）， 靈 敏 度 為87.7%，特異度為85.8%；血流RI 聯(lián)合血清miRNA-92a 診斷CC 的ROC 曲 線 下 面 積 為0.886（P＜0.001）， 靈敏度為82.8%，特異度為78.3%；血流RI 聯(lián)合血清miRNA-18a、miRNA-92a 診 斷CC 的ROC 曲 線 下 面積為0.940（P＜0.001），靈敏度為94.3%，特異度為81.3%（見圖1）。

表23 組血流RI 比較（±s）Table 2 Comparison of blood flow RI in 3 groups

表23 組血流RI 比較（±s）Table 2 Comparison of blood flow RI in 3 groups

注：RI=阻力指數；與正常組比較，aP＜0.05；與CIN 組比較，bP＜0.05

組別 例數 血流RI正常組 120 0.72±0.12 CIN 組 120 0.64±0.11a CC 組 122 0.51±0.12ab F 值 99.88 P 值 ＜0.001

表33 組血清miRNA-18a、miRNA-92a 比較（±s）Table 3 Comparison of serum miRNA-18a and miRNA-92a in 3 groups

表33 組血清miRNA-18a、miRNA-92a 比較（±s）Table 3 Comparison of serum miRNA-18a and miRNA-92a in 3 groups

注：與正常組比較，aP＜0.05；與CIN 組比較，bP＜0.05

組別 例數 血清miRNA-18a 血清miRNA-92a正常組 120 1.3±0.5 1.3±0.5 CIN 組 120 2.9±0.7a 1.9±0.5a CC 組 122 3.8±0.9ab 2.4±0.9ab F 值 372.39 83.36 P 值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

圖1 血流RI、血清miRNA-18a、血清miRNA-92a、血流RI 聯(lián)合血清miRNA-18a、血流RI 聯(lián)合血清miRNA-92a 及血流RI 聯(lián)合血清miRNA-18a、miRNA-92a 診斷CC 的ROC 曲線Figure 1 ROC curve of blood flow RI，serum miRNA-18a，serum miRNA-92a，blood flow RI combined with serum miRNA-18a，blood flow RI combined with serum miRNA-92a，and blood flow RI combined with serum miRNA-18a and miRNA-92a in the diagnosis of cervical carcinoma

表4 CC 影響因素的多因素Logistic 回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of the influencing factors of cervical carcinoma

在我國，CC 是發(fā)病率和病死率僅次于乳腺癌的女性惡性腫瘤，其早期癥狀表現(xiàn)不典型，且目前的篩查診斷方式或在靈敏度或在特異度或在可操作性上存在缺陷，因此易錯過最佳診療時機［9］。TVCDS 作為一種無創(chuàng)的影像學檢查方法，不僅能直接顯示宮頸、血管及管腔內血流狀態(tài)，且能通過軟件將結果量化，是一種便捷、有效的檢查方式［10］。miRNAs 異常通過下調靶基因的表達，在腫瘤發(fā)生及生長中發(fā)揮重要作用［11］。miRNAs 在外周血中含量豐富且較穩(wěn)定，是潛在的腫瘤血清學檢測指標［12-13］。本研究探索TVCDS 聯(lián)合血清miRNA-18a、miRNA-92a 診斷CC 的價值，以期為CC 提供高效、無創(chuàng)的篩查及診斷方式，為CC 的早期治療提供理論基礎。

本研究結果顯示，CIN 組、CC 組HR-HPV 感染發(fā)生率高于正常組，CC 組HR-HPV 感染發(fā)生率高于CIN組，這與HR-HPV 感染是CC 和CIN 的高危因素相符［14］；CIN 組絕經發(fā)生率低于正常組、CC 組，提示CIN 患者在絕經后仍然有CC 發(fā)病高風險。3 組吸煙率、其他性傳播疾病發(fā)生率無差異，與既往流行病學研究結果有出入［15］，這可能與本研究樣本量有限有關，也可能是因為患者主觀對相關因素有所隱瞞。

CC 腫瘤內的血流常表現(xiàn)為高速低阻的狀態(tài)。本研究結果顯示，CC 組CC 腫塊內血管走行復雜，彩色血流呈“火球”狀或網狀；CIN 組宮頸上皮內病變局部血流較豐富，可見數支棒狀或條狀血管；正常組宮頸內部沒有或只有少許血流信號；TVCDS 可以顯示大部分腫瘤內有典型的血流信號，但需要有經驗的超聲科醫(yī)生進行辨別，其診斷CC 的靈敏度和特異度受限。而血流動力學的數據變化可以更客觀地對患者病情進行判斷。CIN 組、CC 組血流RI 均低于正常組，CC 組血流RI 低于CIN 組，提示CC 腫瘤內有豐富的血供，而CIN 作為癌前病變，血管亦有異常生長。

臨床研究表明，包括胃［16］、 結直腸［17］、肺［18］等在內的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展或預后不良與血清miRNA-18a、miRNA-92a 相關［19］。本研究結果顯示，CIN 組、CC 組血清miRNA-18a、miRNA-92a 高于正常組，CC 組血清miRNA-18a、miRNA-92a 高于CIN 組，與既往研究結果［20］一致；且miRNA-92a 具有促進血管增殖的作用，與TVCDS 檢查結果中CC 腫瘤內豐富的血供結果相符。

多因素Logistic 回歸分析結果顯示，年齡、HR-HPV感 染、 絕 經、 血 流RI、 血 清miRNA-18a、 血 清miRNA-92a 是CC 發(fā)生的影響因素，提示上述因素可在一定程度上獨立反映CC 的發(fā)病風險。對CC 發(fā)生的影響程度較大的有HR-HPV 感染、血清miRNA-18a、血流RI 和血清miRNA-92a，提示這4 個指標具有診斷CC 的潛力。然而根據臨床經驗，HR-HPV 感染診斷CC 特異度低，因此本研究深入探究了血流RI 和血清miRNA-18a、miRNA-92a 診斷CC 的價值。

本研究結果顯示，血流RI、血清miRNA-18a、血清miRNA-92a、血流RI 聯(lián)合血清miRNA-92a 診斷CC的ROC 曲線下面積均未達到0.900。而血流RI 聯(lián)合血清miRNA-18a 診斷CC 的ROC 曲線下面積為0.936，靈敏度為87.7%，特異度為85.8%；血流RI 聯(lián)合血清miRNA-18a、miRNA-92a 診斷CC 的ROC 曲線下面積為0.940，靈敏度為94.3%，特異度為81.3%；因此，血流RI 聯(lián)合血清miRNA-18a、miRNA-92a 對CC 的診斷效能較好。

受樣本量和工作條件的限制，本研究對HR-HBV感染與血清miRNA-18、miRNA-92a 的關系未進行深入研究。HR-HBV 感染作為CC 的高危發(fā)病因素，可能一定程度上影響血清學指標的變化。本研究仍有待多中心合作進行大范圍的流行病學調查研究，同時與基礎實驗室合作，探究血清學指標變化的理論基礎。

綜上所述，CC 患者TVCDS 的血流RI 降低，血清miRNA-18a、miRNA-92a 升高；TVCDS 的血流RI 聯(lián)合血清miRNA-18a、miRNA-92a 對CC 的診斷效能高于其單獨診斷效能，且具有易操作的特點，可提高CC 的早期診斷率，值得臨床推廣使用。

作者貢獻：孫明霞、蔣鵬程進行文章的構思與設計；孫明霞、于峰進行研究的實施與可行性分析；劉彩霞進行數據收集與整理、統(tǒng)計學處理、結果的分析與解釋；孫明霞撰寫論文，負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理；范桂蓮進行論文的修訂；張輝進行英文的修訂。

本文無利益沖突。