桂超，鄧萬凱，劉細國

0 引言

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma, NPC）是一種獨特的上皮惡性腫瘤。現(xiàn)今發(fā)病機制尚不明確。其發(fā)病具有明顯的地理和民族分布特點，存在一定的遺傳易感性，并且與EB病毒感染及環(huán)境中的致癌物質(zhì)等多種因素共同作用有關(guān)[1]。隨著放射療法和化學(xué)療法的不斷進步，鼻咽癌患者的生存期較之前明顯改善。但是不良反應(yīng)較大，部分患者難以耐受。因此，研發(fā)不良反應(yīng)小、治療效果更為明顯的鼻咽癌治療藥物成為了現(xiàn)今研究者和一線臨床醫(yī)生所面臨的主要臨床問題。

CX-5461作為一種RNA聚合酶Ⅰ抑制劑，能夠有效阻礙真核細胞生物的核糖體rRNA合成，抑制核糖體正常功能，通過調(diào)控p53進而抑制腫瘤細胞的病理生理功能。因此，其是一種具有廣闊前景的抗腫瘤藥物，現(xiàn)于加拿大開展Ⅱ期臨床試驗（臨床試驗注冊編號：NCT02719977）。本實驗為了證實CX-5461在鼻咽癌治療中的作用，以不同濃度的CX-5461處理CNE-1鼻咽癌細胞系，以觀察其對于CNE-1增殖、遷移、凋亡的影響，并試圖研究其分子機制，為未來的臨床應(yīng)用提供參考。

CX-5461作為一類靶向作用于polyⅠ的抑制劑，早期研究發(fā)現(xiàn)能通過激活p53導(dǎo)致細胞一系列生理病理變化，而p53與NF-κb同時作為細胞內(nèi)一類極為重要的轉(zhuǎn)錄因子，兩者存在一定的相互聯(lián)系。因此我們猜想，CX-5461也可能通過影響NF-κb功能導(dǎo)致細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡等病理生理過程的發(fā)生，進而起到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。本實驗將驗證CX-5461是否通過抑制NF-κb功能活化，進而調(diào)控腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 組織標本 按每季度隨機抽取2~3例的。方法收集2016年1月至2018年2月湖北省腫瘤醫(yī)院19例鼻咽癌手術(shù)患者。所有患者均經(jīng)鼻咽鏡行病理活檢，于鼻咽鏡下取距癌組織3~5 cm的鼻咽部黏膜9例作對照。所取組織均固定后石蠟包埋?；颊呋顧z前未接受放療和化療，均經(jīng)組織活檢病理報告確診為鼻咽癌。排除標準：（1）年齡小于18歲或大于75歲；（2）合并其他部位的原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移癌；（3）罹患嚴重的感染性疾病及免疫功能障礙者；（4）妊娠期和哺乳期女性；（5）精神異?；颊叩取?9例中因1例合并骨轉(zhuǎn)移、1例合并肺轉(zhuǎn)移排除，最終納入17例患者；所有標本的收集均獲得患者的知情同意，并通過湖北省腫瘤醫(yī)院倫理委員會審核批準（編號：LLHBCH2018LW-006）。

1.1.2 細胞培養(yǎng)與處理 鼻咽癌細胞株CNE-1購自武漢大學(xué)細胞庫，在含有10%特級胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）（中國上海BBI公司）及1%青鏈霉素（美國Gibco公司）的RPMI 1640培養(yǎng)基中（美國Gibco公司），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱（德國Binder公司）進行培養(yǎng)。以0.25%含有EDTA的胰酶（美國Hyclone公司）進行消化、傳代。

1.1.3 實驗試劑 CX-5461購自美國MCE公司；NF-κb激活蛋白（NF-κb activating protein, NKAP）購自上海生工公司；免疫組織化學(xué)試劑盒購自武漢博奧森公司、山羊抗兔NF-κb一抗（Western blot 1:1 000稀釋、免疫組織化學(xué) 1:100稀釋）、山羊抗兔磷酸化NF-κb（Ser536）（Western blot 1:1 000稀釋）一抗、山羊抗鼠GAPDH一抗均購自美國Cell Signaling Technology公司。CCK-8試劑盒購自中國碧云天公司，流式周期試劑盒購自中國上海生工公司；Hoechst33342染色液購自上海生工公司，Transwell小室購自美國Costar公司。

1.2 實驗。方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法 標本收集后石蠟包埋，切片置于烤箱65℃融蠟60 min。將融蠟后的玻片水化。隨后將玻片放入枸櫞酸修復(fù)液中，微波爐修復(fù)兩次。修復(fù)液降至常溫后，PBS洗3遍，0.2%Triton，10 min。3%H2O2溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min。山羊血清封閉10 min。一抗4℃孵育過夜。一抗孵育后PBS洗3遍，二抗孵育，37℃，40 min，PBS洗3遍。DAB顯色。正置顯微鏡下觀察。以十三點評分法對免疫組織化學(xué)結(jié)果進行評價：0分，沒有陽性細胞；1分，陽性細胞百分比<10%；2分，陽性細胞百分比≥10%~<50%；3分，陽性細胞百分比≥50%~80%；4分，陽性細胞百分比≥80%；染色強度按照陰性、弱、中、強分別評為0~3分。最終評分為兩指標的乘積。0~1分為陰性，2~5分為弱陽性，6~9分為陽性，10~12分為強陽性。

1.2.2 細胞增殖-毒性檢測實驗 取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化，用培養(yǎng)基稀釋至2×104個/毫升，96孔板每孔移入100 μl的細胞混懸。設(shè)置5組藥物濃度梯度，每組5個復(fù)孔，12 h后待細胞貼壁，移去96孔板中培養(yǎng)基，根據(jù)分組的不同加入不同藥物濃度的細胞培養(yǎng)液，分別于藥物處理12、24、36和48 h后每孔加入10 μl CCK-8，37℃培養(yǎng)箱溫育1 h，酶標儀以450 nm波長分析各組吸光度數(shù)據(jù)。

1.2.3 細胞侵襲實驗 在待測細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細胞，用無血清培養(yǎng)基懸浮細胞，計數(shù)，調(diào)整濃度為2×105個/毫升；在下室加入600～800 μl含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，已經(jīng)鋪好Matrigel膠的上室中加入100～150 μl細胞懸液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；小心取出Transwell小室，吸干上室液體，移到甲醇配置的0.2%結(jié)晶紫染液中，室溫染色15~30 min；輕輕用清水沖洗浸泡數(shù)次，吸去上室液體，用濕棉棒輕輕擦去上室膜表面上的細胞；顯微鏡下每組標本隨機選取9個視野計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果，進行分析。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 取處于對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化，1 500 r/min離心5 min。棄培養(yǎng)基。PBS重懸細胞，1 500 r/min離心5 min，棄PBS，75%酒精固定并重懸細胞，-20℃冰箱過夜。10×染色緩沖液用雙蒸水稀釋成1×緩沖液，PBS洗滌細胞兩次，1×緩沖液重懸細胞，每組細胞懸液中加入5 μl PI染色液至95 μl細胞懸液，混勻，室溫避光孵育10~30 min，流式細胞儀檢測。

1.2.5 Hoechst染色法檢測凋亡細胞 細胞鋪于六孔板上，不同濃度CX-5461處理24 h，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗，棄去PBS，每孔加入適量Hoechst染色液，避光染色5 min，其后棄去Hoechst染色液，加入培養(yǎng)基，于倒置顯微鏡下觀察，每組細胞隨機選取20個視野，統(tǒng)計視野下含有凋亡小體的細胞數(shù)目并進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 We s t e r n b l o t 檢測目標蛋白的變化 CX-5461處理細胞后，收集各組細胞，提取細胞總蛋白，每孔蛋白上樣量為40～80 μg，電泳電壓75 V，電流30 mA，以10%SDS-PAGE膠進行Western blot電泳。以電流200 mA，電壓100 V進行電轉(zhuǎn)。以GAPDH為內(nèi)參，以羊抗鼠、羊抗兔熒光二抗顯影，在Odessy熒光掃膜系統(tǒng)上進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κb在鼻咽癌組織中表達明顯升高

免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，NF-κb在鼻咽癌組織中較癌旁組織表達明顯升高，十三點評分發(fā)現(xiàn)兩者比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000003），見圖1。

2.2 CX-5461通過抑制NF-κb活性抑制鼻咽癌細胞系CNE-1的增殖

將CX-5461以1.25 μmol/L處理CNE-1細胞系。發(fā)現(xiàn)從給藥第2天起藥物處理組增殖速率明顯降低，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0032）；在給藥的同時加入NF-κb激活蛋白NKAP，發(fā)現(xiàn)CX-5461+NKAP組增殖能力較CX-5461組明顯上調(diào)，增殖能力在給予NKAP后有所恢復(fù)，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0002）。而在單獨給予NF-κb激活蛋白NKAP后對于細胞生長狀態(tài)并無明顯影響，見圖2。因此，CX-5461可能通過NF-κb調(diào)控細胞的增殖。

2.3 CX-5461抑制鼻咽癌細胞系CNE-1的侵襲、遷移

在本實驗中，CNE-1細胞系只加入CX-5461溶劑Na2HPO4作為對照組。發(fā)現(xiàn)CNE-1細胞系在1.25 μmol/L CX-5461單獨處理后細胞透膜數(shù)量明顯降低，細胞密度顯著降低，細胞侵襲能力顯著減弱，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.00011）。以上結(jié)果表明CX-5461對于CNE-1細胞系的侵襲、遷移能力具有明顯的抑制作用。其后，在給予同濃度CX-5461的同時加入NF-κb激活蛋白NKAP，發(fā)現(xiàn)CX-5461+NKAP組較CX-5461給藥組細胞透膜數(shù)目明顯增多，細胞密度較CX-5461組顯著增多，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.00007），見圖3。以上研究結(jié)果表明，在給予CX-5461的情況下，激活NF-κb對于CNE-1細胞系的侵襲、遷移能力的維持具有重要作用；同時，CX-5461對鼻咽癌細胞系CNE-1的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移具有極強的抑制作用，且其有可能是通過影響NF-κb的功能進而發(fā)揮影響。

圖1 鼻咽癌與癌旁組織中NF-κb的表達Figure1 NF-κb expression in nasopharyngeal carcinoma and adjacent tissues

圖2 CCK-8檢測CX-5461處理后鼻咽癌細胞CNE-1的增殖Figure2 Proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells CNE-1 after CX-5461 treatment detected by CCK-8

2.4 CX-5461阻滯鼻咽癌細胞系CNE-1細胞周期

CNE-1鼻咽癌細胞系在1.25 μmol/L的CX-5461處理后24 h，CX-5461組與對照組相比，阻滯在G2期的細胞明顯增多，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0008）。CNE-1鼻咽癌細胞系在CX-5461+NKAP重組蛋白聯(lián)合處理24 h后，較對照組無明顯周期阻滯（P=0.791），見圖4。表明CX-5461極可能通過抑制NF-κb活性進而引起CNE-1鼻咽癌細胞系周期阻滯。

2.5 CX-5461促進鼻咽癌細胞系CNE-1的凋亡

Hoechst 33342凋亡小體染色實驗發(fā)現(xiàn)，CNE-1鼻咽癌細胞在1.25 μmol/L的CX-5461處理后，CX-5461組較對照組凋亡小體形成明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.00013）。在CX-5461處理的同時給予NF-κb激活蛋白NKAP，發(fā)現(xiàn)CX-5461+NKAP組較CX-5461組凋亡小體形成的細胞明顯減少，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.00024），見圖5。以上研究結(jié)果表明，適當濃度的CX-5461可以在一定程度上促進CNE-1的凋亡。

2.6 CX-5461通過抑制NF-κb磷酸化誘導(dǎo)CNE-1細胞凋亡

為了進一步確定CX-5461是通過何種途徑、何種方式促進細胞凋亡，后期通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，CX-5461處理CNE-1細胞后NF-κb蛋白總體水平無明顯變化（P=0.487），見圖6。進一步驗證NF-κb在磷酸化水平的變化情況，發(fā)現(xiàn)CX-5461組NF-κb磷酸化水平較對照組明顯降低（P=0.00003），CX-5461+NKAP組較CX-5461組蛋白磷酸化水平增高（P=0.00028）。與此同時，CX-5461組較CX-5461+NKAP組促凋亡蛋白Bax蛋白水平明顯升高（P=0.000011）；抑凋亡蛋白Bcl-2明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0006），見圖6。因此，CX-5461可能通過抑制NF-κb磷酸化進而導(dǎo)致鼻咽癌細胞系CNE-1的凋亡。

圖3 CX-5461處理后CNE-1細胞密度(A~C ×200)和侵襲能力(D~F×200)的變化Figure3 Cell density(A-C ×200) and invasive ability(D-F ×200) of CNE-1 cell line after CX-5461 treatment

圖4 CX-5461處理后CNE-1細胞系細胞周期的變化Figure4 Cell cycle of CNE-1 cell line after CX-5461 treatment

圖5 Hoechst 33342凋亡小體染色實驗檢測鼻咽癌細胞系CNE-1的凋亡 (A~C ×40; D~F ×200)Figure5 Apoptosis of CNE-1 cell line detected by Hoechest apoptotic body fl uorescence staining (A-C ×40; D-F ×200)

3 討論

鼻咽癌發(fā)病與EB病毒明顯相關(guān)，且具有一定的遺傳易感性。研究證實，核糖體除了參與蛋白質(zhì)合成外，還對細胞周期的正常推進、細胞凋亡的發(fā)生以及腫瘤細胞的侵襲、遷移具有極大的影響[2]。因此，核糖體功能對于腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等生理活動有著極其重要的意義。在真核生物細胞中，RNA聚合酶Ⅰ主要負責催化5.8s、18s和28s的rRNA合成，對于保證核糖體形成、維持核糖體功能穩(wěn)定性具有極其重要的作用[3]。核糖體主要由rRNA及核糖體蛋白構(gòu)成。rRNA約占機體RNA的82%，主要包括5srRNA、5.8srRNA、18srRNA和28srRNA。其單獨存在時不存在功能，在核糖體蛋白裝配后起到mRNA支架的作用，促進mRNA與核糖體的結(jié)合，保持翻譯過程的穩(wěn)定性。Zhou等早期研究證實，核糖體蛋白在游離狀態(tài)下能夠與MDM2結(jié)合，抑制MDM2功能，阻礙MDM2對p53的降解，進而調(diào)控細胞周期進展，促進細胞凋亡[4]。Yang等發(fā)現(xiàn)RPL22通過抑制CK2α底物磷酸化進而誘導(dǎo)腫瘤細胞增殖與凋亡[5]。因此，破壞核糖體穩(wěn)定性，抑制rRNA合成，阻斷腫瘤細胞內(nèi)核糖體的合成，對于控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有極其重要的作用[6]。

圖6 CX-5461處理后NF-κb磷酸化，Bax、Bcl-2變化情況Figure6 NF-κb phosphorylation, Bax and Bcl-2 expression after CX-5461 treatment

NKAP（NF-κb activator protein），于2003年生物化學(xué)及生物物理研究通訊（biochemical and biophysical research communications, BBRC）上首次報道，RIP（receptor -interacting protein）在TNF-α激活的NF-κb途徑中具有重要的作用。后期以RIP為誘餌蛋白，研究者通過酵母雙雜交手段，在人的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)一種新蛋白，其能激活NF-κb途徑，促進NF-κb的入核及磷酸化，因此根據(jù)其功能命名為NKAP[7]。

CX-5461作為一種新近研究出來的以RNA poly Ⅰ為靶點的抑制劑，對于核糖體的正常組裝及rRNA的轉(zhuǎn)錄均具有極其重要的作用。其作為一種rRNA合成抑制劑，選擇性抑制RNA PolⅠ驅(qū)動的rRNA轉(zhuǎn)錄，對RNA PolⅡ沒有作用，對rRNA轉(zhuǎn)錄的抑制比對DNA復(fù)制和蛋白翻譯的抑制選擇性高出250到300倍。Li等[8]研究證實，CX-5461能夠使骨肉瘤細胞的周期明顯阻滯于G2期，使得細胞內(nèi)p53及p21在mRNA水平及蛋白質(zhì)水平顯著升高，進而啟動細胞凋亡進程，延緩腫瘤組織體積的增大與腫瘤的外部器官轉(zhuǎn)移。且其與多柔比星聯(lián)合用藥時能夠在一定程度上增強多柔比星對于腫瘤細胞的殺傷力[8]。Duo等發(fā)現(xiàn)以合適狀態(tài)的藥物載體裝載CX-5461，給藥后對于宮頸癌具有極明顯的治療作用及較小的藥物毒副作用[9]。因此，CX-5461對于腫瘤疾病的控制具有明顯的效果。但是關(guān)于其控制腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機制尚有待進一步研究。

早期關(guān)于CX-5461的研究發(fā)現(xiàn)，其通過調(diào)控p53的變化進而促進腫瘤細胞的凋亡。大量研究表明，p53與NF-κb在腫瘤細胞功能調(diào)節(jié)的作用上存在一定的上下游關(guān)系或者共調(diào)控作用[10-11]。因此，我們猜想CX-5461也極有可能通過抑制NF-κb的功能進而影響腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展。

NF-κb廣泛存在于各種細胞中，并參與細胞內(nèi)多種信號傳遞，調(diào)控多種基因的表達。異常激活磷酸化的NF-κb可促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡。因此，NF-κb也成為相關(guān)癌癥藥物作用的靶點。NF-κb是一種早期由Sen等[12]在成熟B淋巴細胞核中發(fā)現(xiàn)的一種細胞核轉(zhuǎn)錄因子，能與免疫球蛋白k鏈基因的增強子κb序列特異性結(jié)合。在正常情況下，NF-κb通常與其抑制蛋白Iκb相結(jié)合，以非活性狀態(tài)貯存于細胞質(zhì)中。其主要包括五位家族成員，c-Rel、NF-κb2（p52）、RelB、RelA（p65）和NF-κbI（p50）[12]。NF-κb在大部分癌組織中表達量明顯高于對照組織，這也與其促進增殖，抑制凋亡的功能相符合。大量研究表明，當NF-κb被激活后，其發(fā)生磷酸化，并大量入核，通過RelA結(jié)合到相關(guān)癌基因的啟動子或增強子，進而調(diào)控腫瘤的細胞周期進程、侵襲、凋亡及血管生成[13]。除此之外，Hinz等[14]發(fā)現(xiàn)，cyclinD1的啟動子序列上存在NF-κb的結(jié)合位點。cyclinD1作為細胞G1期向G2期和S期轉(zhuǎn)化的重要限速因子，其被抑制常導(dǎo)致細胞周期阻滯于G1期。而NF-κb激活后發(fā)生磷酸化，NF-κb大量入核，其結(jié)合到cyclinD1的啟動序列上，調(diào)控cyclingD1的功能進而引起細胞周期阻滯于G1期，這也與本實驗結(jié)果相吻合[14]。且相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白RPL22功能的缺失對于激活NF-κb的功能具有極其重要的作用[15]。本研究觀察在NKAP處理后腫瘤細胞相關(guān)功能是否得到恢復(fù)，結(jié)果也確實與我們預(yù)期較為一致。因此，我們認為，在CX-5461抑制核糖體的裝配后，核糖體相關(guān)蛋白胞外功能激活，抑制NF-κb功能的活化進而促進細胞凋亡及遷移。

本研究證實，CX-5461可以通過影響NF-κb的磷酸化調(diào)控鼻咽癌細胞系CNE-1的周期進程、增殖、侵襲、凋亡，進而可能影響鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。但是NF-κb的活化調(diào)控細胞周期、細胞凋亡的具體機制尚需要進一步探索。