徐 昊，黃小平，張 偉，鄧常清

(湖南中醫(yī)藥大學分子病理實驗室，中西醫(yī)結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208)

黃芪當歸5 ∶1配伍的當歸補血湯(Danggui Buxue Tang, DBT)主要用于造血功能低下的治療。藥理研究表明，DBT具有明顯促造血作用，可促進小鼠骨髓造血抑制模型外周血象恢復和造血祖細胞增殖，上調造血生長因子(hemopoietic growth factor, HGF)促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)、促血小板生成素(thrombopoietin, TPO)和粒-單核細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)的表達[1-2]。

雖然傳統的DBT為芪歸5 ∶1配伍，但在臨床使用時仍有不同。有研究表明，在貧血模型中，當歸-黃芪以1 ∶5～5 ∶1配伍對促進造血具有協同作用[3]。我們的研究也表明，在小鼠骨髓造血抑制模型，黃芪當歸1 ∶1、1 ∶2.5、1 ∶5配伍的促造血作用較強，二者配伍具有增效作用[4]。且芪歸1 ∶1配伍，其主要活性成分阿魏酸、黃芪甲苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷在藥物提取中的溶出量增多，以及小腸中的吸收增加[5]，提示它們可能為其主要藥效物質。但是這5種成分對造血各環(huán)節(jié)有何影響？5種成分配伍是否具有芪歸配伍相同的作用？這些問題尚不清楚。因此，本實驗采用骨髓造血抑制模型，研究了5種主要活性成分配伍的促造血作用，為揭示其促造血作用的特點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物黃芪和當歸飲片，均購自湖南省松齡堂中藥飲片有限公司，經鑒定，黃芪為豆科(Leguminosae)植物蒙古黃芪AstragalusmembranaceusBunge var.mongholicus(Bge.) P.K. Hsiao的干燥根，產地內蒙古。當歸為傘形科(Umbelliferae)植物Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，產地甘肅。

當歸主要活性成分：阿魏酸(ferulic acid)(純度>99%，批號：rq0838)；黃芪主要活性成分：黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ)(純度>98.5%，批號：16022804)、芒柄花素(formononetin)(純度>98.5%，批號：16031 005)、毛蕊異黃酮(calycosin)(純度>98.5%，批號：16031110)、毛蕊異黃酮苷(calycosin glycoside)(純度>98.5%，批號：16031205)。以上均購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2 試劑重組小鼠促血小板生成素(rm-TPO)(Absin，批號：P40226)；重組小鼠粒-單核細胞集落刺激因子(rm-GM-CSF)(SinoBio，批號：P01587)；重組小鼠促紅細胞生成素(rm-EPO)(Cell Signaling，批號：0004)；小鼠白介素3(interleukin-3, IL-3)(Cell Signaling，批號：0012)； IMEM完全培養(yǎng)基(Gibco，批號：1846253)；L-谷氨酰胺(VETEC，批號：WXBC1767V)； 特級馬血清(Solarbio，批號：331E051)；環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：16071925)；小鼠GM-CSF(Ex Cell Bio，批號：21F343)、TPO(Cloud-Clone Corp，批號：L161130210)、EPO(Cloud-Clone Corp，批號：L161124009)酶聯免疫吸附實驗(ELISA)測定試劑盒。

1.3 實驗動物SPF級昆明種小鼠，♀♂各半，6周齡，體質量20～25 g，由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供，合格證號：SCXK(湘)2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，使用環(huán)境合格證號：SYXK(湘)2013-0005。

1.4 黃芪-當歸1 ∶1配伍水提取物(以下簡稱提取物)的制備稱取黃芪和當歸飲片各40 g，用水熱回流法提取，第1次加8倍量水，提取2 h。第2次及第3次各加6倍量水，提取1 h。合并3次提取物并過濾，濃縮至生藥含量0.24 g·L-1，再加入1 g·L-1苯甲酸鈉后，4 ℃保存。

1.5 提取物中主要活性成分測定

1.5.1提取物供試品及對照品溶液制備 取10 mL提取物，置60 ℃干燥，再加入70%甲醇溶液5 mL，震蕩后靜置過夜，次日再次震蕩后，4 000 r·min-1離心15 min，上清液以0.22 μm微孔濾膜過濾，即得2倍濃縮的供試樣品液。

精確稱取阿魏酸1.82 mg、芒柄花素1.83 mg、黃芪甲苷2.16 mg、毛蕊異黃酮1.83 mg、毛蕊異黃酮苷2.51 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加入10 mL甲醇。超聲混勻后，即成對照品溶液。

1.5.2提取物5種主要活性成分含量的測定 以超高壓液相色譜/質譜聯用(UPLC-MS/MS)法測定。Waters-Xevo-G2-S Qtof超高效液相色譜-質譜聯用儀(美國Waters公司，masslynx V4.1色譜工作站)。色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫(0～1 min，95%→90% A；1～4 min，90%→80% A；4～7 min，80%→65% A；7～10 min，65%→50% A；10～11 min，50%→5% A；11～12 min，5%→5% A；12～13 min，5%→95% A；13～15 min，95%→95% A)。柱溫35 ℃，流速0.4 mL·min-1，進樣體積1 μL。以上述條件測得樣品和對照品的UPLC圖譜，通過樣品中各成分的峰面積與對照品峰面積，計算樣品中5種活性成分的含量。

1.6 5種活性成分及其配伍劑量的確定及藥物制備根據芪歸1 ∶1配伍提取物中5種活性成分的含量，計算各成分的給藥劑量。要求5種成分單獨及其配伍給藥時，各成分的給藥劑量與提取物中各成分的劑量相等。芪歸1 ∶1配伍的給藥劑量為6 g·kg-1，根據水提物中5種成分的含量(見結果)，換算得各成分的小鼠給藥劑量為：阿魏酸574.74 μg·kg-1，黃芪甲苷275.52 μg·kg-1，芒柄花素607.26 μg·kg-1，毛蕊異黃酮391.26 μg·kg-1，毛蕊異黃酮苷1 394.28 μg·kg-1?；钚猿煞峙湮榈慕o藥劑量為上述各成分單用劑量相加。精確稱取各藥物成分，以4 g·L-1羧甲基纖維素鈉溶液配制。

1.7 實驗分組與處理小鼠隨機分為空白對照組(blank)、模型組(model)、阿魏酸組、黃芪甲苷組、芒柄花素組、毛蕊異黃酮組、毛蕊異黃酮苷組、活性成分配伍組(active components combination)、芪歸配伍提取物組(Angelica+Astragalus)，每組12只。動物先適應性飼養(yǎng)2 d。空白組每日給予25 mL·kg-1羧甲基纖維素鈉溶液灌胃7 d；模型組同上灌胃等量羧甲基纖維素鈉，于d 3腹腔注射環(huán)磷酰胺(360 mg·kg-1)，連續(xù)3 d；各藥物組均連續(xù)給藥7 d，并于d 3 同上注射環(huán)磷酰胺。各組于末次給藥后24 h檢測。

1.8 外周血象測定心臟采血抗凝后，以全自動血液分析儀檢測外周血紅細胞(red blood cell, RBC)、白細胞(white blood cell, WBC)、血小板(platelet, Pt)數及血紅蛋白(haemoglobin, HGB)含量。

1.9 血清HGF含量測定心臟采血后制備血清，ELISA法測定血清GM-CSF、TPO和EPO含量。

1.10 造血祖細胞培養(yǎng)和集落測定處死后取右側后肢，浸泡于75%酒精中，以無菌PBS沖洗干凈。分離股骨，露出骨髓腔，用3 mL IMEM培養(yǎng)液將骨髓腔內細胞沖出，反復吹打，4 ℃、3 000 r·min-1離心8 min，去上清，加入2 mL IMEM培養(yǎng)液，反復吹打，過200目細胞篩，調細胞數至2×108·L-1。將制備好的骨髓有核細胞與培養(yǎng)體系混合后，加入6孔細胞培養(yǎng)板內，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)體系組成見Tab 1。紅系集落形成單位(erythroid colony forming unit, CFU-E)培養(yǎng)3 d后計數，爆式紅系集落形成單位(burst forming unit-erythroid, BFU-E)、粒-單核細胞集落形成單位(granulocyte-monocyte colony foming unit, CFU-GM)、巨核細胞集落形成單位(megakaryocyte colony forming unit, CFU-MK)培養(yǎng)7 d后計數。CFU-E、BFU-E經二甲氧基聯苯胺染色法鑒定，呈紅色者為陽性集落。CFU-MK經乙酰膽堿酯酶染色鑒定，呈棕色者為陽性集落。CFU-GM經氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色法鑒定，呈鮮紅色者為陽性集落。鏡下觀察，CFU-E >8個細胞、BFU-E和CFU-GM >50個細胞、CFU-MK>3個細胞者，均計為1個集落。計數每孔造血祖細胞的集落形成數。

Tab 1 Constitution of CFU-GM, CFU-MK, CFU-E and BFU-E culture systems

1.11骨髓造血組織面積測定分離左側股骨，10%中性甲醛固定3 d，流水沖洗后放入EDTA脫鈣液中，4 ℃攪拌脫鈣40 d后，流水沖洗。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，在股骨頭下2 mm處，垂直于股骨干進行連續(xù)切片，厚度5 μm。將切片貼于經多聚賴氨酸處理的玻片上，脫蠟處理后，行蘇木精-伊紅(HE)染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下每張切片隨機取3個不同視野拍照，用Image-Pro Plus圖像分析軟件測定骨髓造血組織面積和骨髓腔總面積，計算骨髓造血組織面積占骨髓腔總面積的百分比作為骨髓造血組織面積。

2 結果

2.1 黃芪當歸1 ∶1配伍提取物5種活性成分測定結果見Fig 1、Tab 2。測得提取物中5種活性成分含量及換算成1 g生藥中各成分的含量見Tab 2。

Fig 1 UPLC chromatogram of five active components

2.2 各組外周血象的比較Tab 3結果顯示，與空白組比較，模型組WBC明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，阿魏酸組、活性成分配伍組、提取物組WBC明顯增加(P<0.05)；與活性成分配伍組比較，芒柄花素組、毛蕊異黃酮組、毛蕊異黃酮苷組WBC明顯降低(P<0.05)。與空白組比較，模型組Pt明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，阿魏酸組、黃芪甲苷組、活性成分配伍組、提取物組Pt明顯增加(P<0.05，P<0.01)；與活性成分配伍組比較，芒柄花素組、毛蕊異黃酮苷組Pt明顯降低(P<0.05，P<0.01)。與空白組比較，模型組RBC和HGB均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，各成分單用組、活性成分配伍組、提取物組RBC和HGB均明顯增加(P<0.05，P<0.01)。

2.3 各組造血生長因子的比較Tab 4結果顯示，與空白組比較，模型組GM-CSF明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，阿魏酸組、毛蕊異黃酮組、活性成分配伍組、提取物組GM-CSF明顯增加(P<0.05，P<0.01)；與活性成分配伍組比較，阿魏酸組、黃芪甲苷組、芒柄花素組、毛蕊異黃酮苷組GM-CSF明顯降低(P<0.05，P<0.01)。與空白組比較，模型組TPO明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，各成分單用組、活性成分配伍組、提取物組TPO明顯增加(P<0.05，P<0.01)；與活性成分配伍組比較，黃芪甲苷組、芒柄花素組TPO明顯降低(P<0.01)。與空白組比較，模型組EPO明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，阿魏酸組、毛蕊異黃酮組、毛蕊異黃酮苷組、活性成分配伍組、提取物組EPO明顯增加(P<0.05，P<0.01)；與活性成分配伍組比較，黃芪甲苷組、芒柄花素組EPO明顯降低(P<0.05)。

Tab 2 Contents of main active components in extract

Tab 3 Comparison of peripheral blood among each group n=12)

#P<0.05vsblank;*P<0.05,**P<0.01vsmodel;△P<0.05,△△P<0.01vsactive components combination

Tab 4 Comparison of serum hematopoietic growth factors among each group n=12)

#P<0.05,##P<0.01vsblank;*P<0.05,**P<0.01vsmodel;△P<0.05,△△P<0.01vsactive components combination

2.4 各組骨髓造血組織面積的比較與空白組比較，模型組骨髓造血組織面積明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，阿魏酸組、活性成分配伍組，提取物組骨髓造血組織面積明顯增加(P<0.05，P<0.01)；與活性成分配伍組比較，各成分單用組骨髓造血組織面積明顯減少(P<0.01)。見Tab 4、Fig 2。

2.5 各組造血祖細胞集落數的比較Tab 5結果顯示，與空白組比較，模型組CFU-GM明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，阿魏酸組、芒柄花素組、毛蕊異黃酮組、毛蕊異黃酮苷組、活性成分配伍組、提取物組CFU-GM均明顯增加(P<0.05，P<0.01)；與活性成分配伍組比較，黃芪甲苷組、芒柄花素組CFU-GM均明顯降低(P<0.01)。與空白組比較，模型組CFU-MK明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，阿魏酸組、芒柄花素組、毛蕊異黃酮組、毛蕊異黃酮苷組、活性成分配伍組、提取物組CFU-MK均明顯增加(P<0.01)；與活性成分配伍組比較，阿魏酸組CFU-MK明顯增加，黃芪甲苷組、毛蕊異黃酮組均明顯降低(P<0.01)。與空白組比較，模型組CFU-E明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，各活性成分單用組、活性成分配伍組、提取物組CFU-E均明顯增加(P<0.05，P<0.01)；與活性成分配伍組比較，黃芪甲苷組、芒柄花素組、毛蕊異黃酮組、毛蕊異黃酮苷組CFU-E均明顯降低(P<0.01)。與空白組比較，模型組BFU-E明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，阿魏酸組、活性成分配伍組、提取物組BFU-E均明顯增加(P<0.01)；與活性成分配伍組比較，黃芪甲苷組、芒柄花素組、毛蕊異黃酮組、毛蕊異黃酮苷組BFU-E均明顯降低(P<0.01)。

Tab 5 Comparison of colony number of hematopoietic progenitor cells among each group (per n=12)

#P<0.05,##P<0.01vsblank;*P<0.05,**P<0.01vsmodel;△△P<0.01vsactive components combination

Fig 2 Morphological pattern of bone marrow hematopoietic tissues in each group (HE staining×100)

A:Blank;B:Model;C:Ferulic acid;D:Astragaloside IV;E:Formononetin;F:Calycosin;G:Calycosin glycoside;H:Active components combination;I:Angelica+Astragalus.

3 討論

環(huán)磷酰胺可引起骨髓造血功能抑制，停藥后其骨髓抑制可自行恢復[6]。因此，本實驗采用連續(xù)注射環(huán)磷酰胺3 d，于注射后d 2觀察造血功能的恢復情況。

芪歸配伍補血作用的活性成分已見相關研究。正常和血虛大鼠口服DBT后，肝臟中主要活性成分(阿魏酸、咖啡酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素和黃芪甲苷)的含量明顯高于其他組織[7]。芪歸1 ∶1、1 ∶2.5、1 ∶5 配伍有明顯的促造血作用，且芪歸1 ∶1配伍可促進黃芪甲苷、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素和阿魏酸的溶出和在大鼠離體小腸段的吸收[4]。提示這些成分可能是其促造血的主要藥效物質。因此，本實驗研究了5種主要成分及其配伍的補血作用。研究發(fā)現，芪歸1 ∶1配伍和5種成分配伍均可升高RBC、WBC、Pt和HGB含量，增加骨髓造血組織面積，二者作用相當，表明5種成分是黃芪當歸配伍促造血的主要藥效物質。進一步分析表明，5種成分均可升高RBC和HGB，表明5種成分可能為升高紅細胞的主要藥效物質。阿魏酸可升高WBC，表明它可能是升高白細胞的主要藥效物質。阿魏酸、黃芪甲苷可升高Pt，表明二者可能是升高血小板的主要藥效物質。骨髓形態(tài)學研究表明，只有阿魏酸可增加骨髓造血組織面積，提示阿魏酸可能是抑制骨髓造血組織萎縮的主要藥效物質。

血細胞生成是在骨髓腔中由造血干/祖細胞增殖、分化而成,這一過程需依賴HGF與其相應受體。HGF主要有EPO、TPO和集落刺激因子，可直接作用于骨髓造血前體細胞，促進其增殖、定向分化。EPO主要由腎臟分泌，可使紅系祖細胞池擴大及促進祖細胞分化和成熟[8]。GM-CSF來源于T 細胞、 單核巨噬細胞、內皮細胞、成纖維細胞等，可促進粒、紅、單核、巨核系造血干/祖細胞增殖分化[9]。TPO可促進巨核細胞增殖和血小板生成[10]。研究表明，DBT能促進骨髓抑制小鼠HGF(EPO、TPO和GM-CSF)的表達[2]，以及體外培養(yǎng)的Hep3B細胞表達EPO[11]，促進造血祖細胞增殖[4]。本研究進一步證明，芪歸1 ∶1配伍和5種活性成分配伍均可使血清EPO、TPO、GM-CSF含量增加，二者作用相當。但只有阿魏酸、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷可升高血清EPO含量，提示這3種成分可能是促進EPO合成與分泌的主要物質。阿魏酸、毛蕊異黃酮可升高血清GM-CSF含量，提示此兩種成分可能是促進GM-CSF合成與分泌的主要藥效物質。5種成分均可使血清TPO含量升高，提示5種成分可能均可促進TPO合成與分泌。體外細胞實驗研究表明，DBT增加EPO表達的作用與Raf/MEK/ERK信號通路活化有關[12]。DBT可促進雌激素應答元件激活和雌激素受體α(estrogen receptor α, ERα)磷酸化，抑制巨核細胞凋亡，這些作用可被MAPK抑制劑、雌激素受體抑制劑和ERK1/2抑制劑阻斷[11，13-14]。提示DBT誘導HGF表達和促進血細胞生成的作用與MAPK信號通路、雌激素受體信號通路等有關。另有研究表明，骨髓造血微環(huán)境是影響造血的重要因素，骨髓基質細胞可通過分泌多種HGF改善造血微環(huán)境。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是骨髓造血微環(huán)境的重要組成細胞，具有支持造血的作用，促進MSC增殖可改善造血微環(huán)境誘導造血相關因子表達[15]。因此，黃芪和當歸配伍及其有效成分促進造血和HGF合成與分泌的作用，可能與上述多個細胞、多個信號途徑有關，但其具體作用機制有待進一步闡明。

造血祖細胞是一類具有增殖能力的原始骨髓有核細胞，可由不同的HGF刺激而生成對應的祖細胞集落。目前已知的3類主要造血祖細胞分別是：① 粒-單核細胞系祖細胞，必須在GM-CSF作用下形成CFU-GM；② 巨核細胞系祖細胞，必須在TPO作用下形成CFU-MK；③ 紅系祖細胞，必須在EPO作用下形成CFU-E和BFU-E[16]。因此， 檢測造血祖細胞增殖可反映造血能力。研究表明，芪歸5 ∶1和1 ∶1配伍均可促進造血祖細胞增殖[2,4]。本研究結果進一步表明，芪歸1 ∶1配伍和5種成分配伍均可使CFU-GM、CFU-MK、CFU-E和BFU-E集落數增加，兩者作用相當。提示芪歸1 ∶1配伍及5種成分配伍均可促進造血祖細胞增殖。這可能是黃芪和當歸中的藥效物質通過促進多種細胞合成與分泌HGF，從而促進了造血祖細胞增殖。而阿魏酸、黃芪甲苷、芒柄花素、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷均可促進CFU-E和BFU-E增殖，提示5種成分可能均具有促進紅系祖細胞增殖的作用。阿魏酸、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷均可促進CFU-MK增殖，提示它們可能是促進巨核系祖細胞增殖的主要藥效物質。阿魏酸、芒柄花素、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷均可促進CFU-GM增殖，表明它們可能是促進粒-巨噬細胞系祖細胞增殖的主要藥效物質。