劉巧洲，郭 靜，石 磊，李 嬌，楊慶雄，孫黔云

(1. 貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550001；2.貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550014；3. 貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550014)

疼痛是諸多病征共有的癥狀，是動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)傷害刺激的感覺(jué)。疼痛研究的焦點(diǎn)在于疼痛發(fā)生的機(jī)制以及干預(yù)治療的策略和藥物研究[1-2]。補(bǔ)體旁路激活會(huì)導(dǎo)致炎癥和組織損傷[3]。有研究表明，補(bǔ)體與某些神經(jīng)病理性疼痛關(guān)系密切[4-5]，但其與非神經(jīng)性疼痛的關(guān)系尚不清楚。本研究用眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)特異抑制補(bǔ)體旁路途徑，觀察小鼠對(duì)疼痛的反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑SPF級(jí)KM小鼠，♀，體質(zhì)量18～22 g，中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證：SCXK(軍)2012-0011；普通新西蘭兔，♂，2.5 kg，重慶騰鑫生物技術(shù)公司提供，合格證：SCXK(渝)2017-0010。CVF由本實(shí)驗(yàn)室制備，方法同文獻(xiàn)[6]；其他試劑均為符合實(shí)驗(yàn)要求的國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 儀器MD-190酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司)；5810R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；YLS-6B智能熱板儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)；超低溫冰箱(中科美菱科技股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1CVF抑制小鼠血清補(bǔ)體旁路途徑測(cè)定 小鼠尾靜脈注射0.05 μg·g-1CVF，毛細(xì)管眼眶采取給藥前和給藥后1、3、6、12、24、48、72、120 h的血液，制備血清，參照文獻(xiàn)[7]，測(cè)定并計(jì)算補(bǔ)體旁路溶血活性。

1.3.2熱板法 熱板儀55 ℃篩選合格小鼠32只，隨機(jī)均分為4組：0.05 μg·g-1CVF組和對(duì)照組、0.075 μg·g-1CVF組和對(duì)照組，對(duì)照組給予等體積生理鹽水。記錄小鼠給藥前和給藥后1、3、6、12、24、48 h的痛覺(jué)反應(yīng)時(shí)間，計(jì)算痛閾提高百分率：痛閾提高百分率=(藥后痛覺(jué)反應(yīng)時(shí)間-藥前痛覺(jué)反應(yīng)時(shí)間)/藥前痛覺(jué)反應(yīng)時(shí)間×100%。

1.3.3醋酸扭體法 32只小鼠隨機(jī)均分為4組：0.05 μg·g-1CVF組和對(duì)照組、0.075 μg·g-1CVF組和對(duì)照組，對(duì)照組給予等體積生理鹽水。在給藥后1、6、12、24、48 h，腹腔注射0.6%醋酸0.1 mL，記錄15 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)，計(jì)算扭體反應(yīng)抑制率：扭體反應(yīng)抑制率=(對(duì)照組扭體次數(shù)-實(shí)驗(yàn)組扭體次數(shù))/對(duì)照組扭體次數(shù)×100%。

Tab 1 Time of pain response of mice after treated with different doses of

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs0 h

Tab 2 Twisting number of mice after treated with different doses of

**P<0.01vscontrol

2 結(jié)果

2.1 CVF抑制補(bǔ)體旁路途徑的作用靜脈注射CVF后，小鼠補(bǔ)體旁路溶血活性快速下降。給藥1 h時(shí)，補(bǔ)體活性降至(7.34±1.74)%，3、6 h時(shí)降至(5.89±2.28)%、(5.6±2.13)%，72 h時(shí)已回升至(34.85±7.78)%，120 h已基本恢復(fù)至(88.56±16.57)%。

2.2 CVF抑制小鼠熱疼痛反應(yīng)的作用CVF能明顯抑制小鼠對(duì)熱疼痛的反應(yīng)。與給藥前相比，0.05 μg·g-1CVF組在給藥后3 h的痛覺(jué)反應(yīng)時(shí)間明顯延緩(P<0.05)；0.075 μg·g-1CVF組在給藥后1、3、6、12 h的痛覺(jué)反應(yīng)時(shí)間均明顯延緩(P<0.01)。與對(duì)照組相比，0.05 μg·g-1CVF 組在給藥后3、6 h的痛閾百分率明顯提高(P<0.01)；0.075 μg·g-1CVF組在給藥后1、3、6、12 h的痛覺(jué)反應(yīng)時(shí)間明顯延緩(P<0.01)，其痛閾百分率明顯提高(P<0.01)。見Tab 1。

2.3 CVF抑制小鼠醋酸扭體反應(yīng)CVF能有效抑制醋酸造成的小鼠扭體反應(yīng)。Tab 2結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，0.05、0.075 μg·g-1CVF組小鼠均在給藥后1、6 h的扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01)；扭體抑制率在1 h時(shí)分別為(63.19±9.28)%、(64.65±17.83)%，6 h時(shí)分別為(61.11±19.43)%、(49.82±15.99)%，12 h時(shí)分別為(2.9±26.31)%、(20.86±39.43)%，24 h時(shí)分別為(18.66±55.92)%、(22.73±22.96)%，48 h時(shí)分別為(0.48±42.15)%、(12.12±14.7)%。

3 討論

本研究表明，尾靜脈注射CVF抑制小鼠體內(nèi)補(bǔ)體旁路途徑后，能明顯減輕小鼠對(duì)熱疼痛和醋酸刺激的反應(yīng)，且這種抑制作用表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系；小鼠對(duì)疼痛的反應(yīng)與CVF致小鼠血清中補(bǔ)體旁路的變化有較好的對(duì)應(yīng)性。熱板法是一種篩選中樞性鎮(zhèn)痛藥的經(jīng)典方法，醋酸扭體法適用于中樞和外周鎮(zhèn)痛藥的篩選。因此，上述結(jié)果提示，血清補(bǔ)體旁路與小鼠疼痛反應(yīng)，尤其是中樞性疼痛可能有密切關(guān)聯(lián)，這為進(jìn)一步研究補(bǔ)體與疼痛的關(guān)系及潛在的藥物靶點(diǎn)提供了參考。