涂獻坤，楊 濱，涂德文，梁日生，石松生

(福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科，福建省神經(jīng)外科研究所，福建 福州 350001)

炎癥反應是介導缺血性腦損傷的病理生理機制之一，藥物通過抗炎癥反應，已被證實可減輕缺血性腦損傷，炎癥反應已是治療缺血性腦中風的重要靶點之一[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可通過抑制腦缺血炎癥反應，從而保護缺血性腦損傷[2]。PI3K/Akt信號通路是一種促神經(jīng)細胞生存的信號通路，我們前期還發(fā)現(xiàn)，5-脂氧合酶抑制劑齊留通(zileuton)可通過激活PI3K/Akt信號通路，減輕缺血性腦損傷[3]，但是丙泊酚是否通過激活PI3K/Akt信號通路減輕缺血性腦損傷，目前研究較少，本研究將通過動物實驗闡明，并進一步探討其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 Akt抑制劑LY294002、氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染料，購自Sigma公司；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒，購自南京建成生物公司；p-Akt、Akt抗體，購于Santa Cruz公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素1β(interleukin 1β, IL-1β)ELISA檢測試劑盒，購自武漢博士德公司。

1.1.2實驗動物 ♂清潔級SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購自上海斯萊克實驗動物公司，許可證號：SCXK(滬)2003-0003。

1.1.3儀器 立體定向注射儀(深圳瑞奧德公司)；低溫離心機、酶標儀(美國Thermo公司)；紫外分光光度計(美國Amsham公司)；恒壓電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 動物分組、動物模型制備及腦室內(nèi)注射隨機將大鼠分為4組，即對照組、溶媒組、丙泊酚治療組和LY294002干預組。腦缺血后，丙泊酚50 mg·kg-1腹腔注射給藥，給藥劑量參考課題組前期發(fā)表論文[2]。大鼠腦缺血模型的建立參考既往文獻[3-4]，線栓(直徑0.32 mm)購自深圳瑞沃德公司，10%水合氯醛(1 mL)腹腔注射麻醉，鈍性分離右側(cè)頸總動脈、右側(cè)頸外動脈、右側(cè)頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈。在頸外動脈近分叉處剪一“V’形切口，插入線栓，將栓線送至大腦中動脈起始處，進線約(18.0±2.0)mm，栓塞2 h后退出線栓，血流再灌注。動物手術全過程使用加熱墊，保持肛溫37 ℃。

用DMSO溶解LY294002，PBS稀釋成10 μmol·L-1。建模前30 min，取10 μL，運用立體定向注射儀行腦室內(nèi)注射。定向儀參數(shù)：以前囟前方0.8 mm，中線外側(cè)1.5 mm為穿刺點，穿刺深度3.5 mm，給藥劑量及方法參考課題組前期工作[5]。

1.3 評估大鼠神經(jīng)功能障礙神經(jīng)功能障礙評分方法參考既往文獻[2]。無神經(jīng)功能障礙者為0分；提起大鼠尾巴，對側(cè)前肢屈曲者為1分；行走時在地上打轉(zhuǎn)，靜止時身體無偏向?qū)?cè)者為2分；行走時地上打轉(zhuǎn)，靜止時身體也偏向?qū)?cè)者為3分；嚴重意識障礙無法運動者為4分。

1.4 計算腦梗死體積腦缺血相應時間，取大腦，冷凍10 min后，沿冠狀位將大腦切成每片厚度約2 mm的6片，于2% TTC溶液中避光孵育20 min，每面各10 min。無梗死組織呈鮮紅色，梗死腦組織呈白色。利用軟件測量各腦片梗死面積，并按公式計算腦梗死體積，V=t×(A1+A2+…An)，V梗死體積，t腦片厚度，A梗死面積。以腦梗死比進行統(tǒng)計(梗死體積/對側(cè)腦體積)，計算方法參考既往文獻[2]。

1.5 評估腦水腫程度通過計算腦含水量可以評估腦水腫程度。取大腦，用濾紙吸除腦表面的水珠，并用吹風機冷風吹干，稱重獲得濕重(wet weight，WW)，放烤箱烤干后，再稱重獲得干重(dry weight，DW)，依據(jù)如下公式計算腦含水量：腦含水量=(WW-DW)/WW×100%，腦含水量和腦水腫程度呈正比，計算方法參考既往文獻[6]。

1.6 檢測中性粒細胞在腦缺血中的浸潤程度通過檢測腦組織MPO可反映中性粒細胞在腦組織的浸潤程度。腦缺血24 h，取大鼠腦組織，按試劑盒說明書步驟操作，計算MPO含量，參考既往文獻[6]。

1.7 ELISA法檢測血漿TNF-α和IL-1β的含量股靜脈取血，4 ℃離心15 min獲得上清，將標準蛋白樣品和待測樣品加入包被好一抗的96孔板，按試劑盒說明書步驟操作，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算各待測樣品的TNF-α和IL-1β含量，參考既往文獻[6]。

1.8 Western blot法檢測大腦p-Akt和Akt的表達用試劑盒提取缺血腦組織的總蛋白，并測定蛋白濃度。經(jīng)分離膠和濃縮膠電泳、轉(zhuǎn)膜后，NC膜用一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，經(jīng)顯影、定影獲得蛋白條帶，用Quantity One軟件分析蛋白條帶，參考既往文獻[6]。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚減輕神經(jīng)功能障礙和腦梗死體積的作用被LY294002抑制腦缺血24 h，大鼠神經(jīng)功能障礙評分增高(P<0.01)，丙泊酚可減輕大鼠腦缺血誘導的神經(jīng)功能損傷(P<0.01)，丙泊酚的這種作用被腦室內(nèi)注射LY294002所抑制(P<0.01)，見Tab 1。腦缺血24 h，大鼠腦梗死比增大(P<0.01)，丙泊酚可減輕大鼠腦缺血的腦梗死比(P<0.05)，丙泊酚的這種作用被腦室內(nèi)注射LY294002抑制(P<0.05)，見Tab 1、Fig 1。

Tab 1 Propofol reduced neurological deficit scores and cerebral infarct size in rats of cerebral ischemia, which were inhibited by LY294002 n=6)

**P<0.01vssham;#P<0.05,##P<0.01vsMCAO;△P<0.05,△△P<0.01vspropofol

Fig 1 Representative TTC staining images from sham, MCAO, propofol-treated and LY294002-treated groups

2.2 丙泊酚減輕缺血性腦水腫的作用被LY294002抑制腦缺血24 h大鼠腦組織含水量明顯升高(P<0.01)，丙泊酚明顯降低大鼠腦含水量(P<0.01)，丙泊酚的這種作用被腦室內(nèi)注射LY294002抑制(P<0.05)，見Tab 2。

2.3 丙泊酚抑制MPO活性的作用被LY294002抑制腦缺血24 h，缺血側(cè)腦組織MPO活性明顯增高(P<0.01)，表明缺血腦組織炎性細胞浸潤增加，丙泊酚可降低缺血腦組織MPO的活性(P<0.01)，即抑制炎癥反應，丙泊酚的抗炎癥作用被腦室內(nèi)注射LY294002抑制(P<0.05)，見Tab 2。

Tab 2 Propofol reduced cerebral water content and MPO activity in rats of cerebral ischemia, which were inhibited by LY294002 n=6)

**P<0.01vssham;##P<0.01vsMCAO;△P<0.05vspropofol

2.4 丙泊酚降低TNF-α和IL-1β水平的作用被LY294002抑制如Fig 2所示，腦缺血24 h，血漿TNF-α和IL-1β的表達明顯增高(P<0.01)，丙泊酚可明顯降低TNF-α和IL-1β的水平(P<0.01)，丙泊酚抑制TNF-α和IL-1β的作用被腦室內(nèi)注射LY294002抑制(P<0.05)。

Fig 2 Propofol decreased expression of TNF-α and IL-1β after cerebral ischemia in rats, which were inhibited by LY294002 n=6)

**P<0.01vssham;##P<0.01vsMCAO;△P<0.05,△△P<0.01vspropofol

2.5 丙泊酚激活PI3K/Akt信號通路的作用被LY294002抑制如Fig 3所示，腦缺血24 h，缺血側(cè)腦組織p-Akt的蛋白表達明顯降低(P<0.01)，丙泊酚上調(diào)腦缺血p-Akt的蛋白表達水平(P<0.01)，丙泊酚調(diào)節(jié)Akt磷酸化表達的作用被LY294002抑制(P<0.01)，而總Akt的蛋白表達水平各組之間差異無顯著性。

Fig 3 Propofol increased expression of p-Akt after cerebral ischemia in rats, which was inhibited by LY294002 n=6)

*P<0.05,**P<0.01vssham;##P<0.01vsMCAO;△△P<0.01vspropofol

3 討論

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可以減輕大鼠腦缺血損傷，進一步的研究表明，丙泊酚可抑制大鼠缺血腦組織的中性粒細胞浸潤，這表明丙泊酚可抑制腦缺血炎癥反應，丙泊酚的神經(jīng)保護作用與其抗炎癥反應作用有關。此外，丙泊酚抑制NF-κB和TNF-α的表達，這可能是其抑制腦缺血炎癥反應和神經(jīng)保護作用的機制[2]，但其深入的分子機制仍未被全部闡明。

本研究借助腦立體定向儀，將Akt抑制劑LY294002注入已建立腦缺血模型的大鼠側(cè)腦室內(nèi)，并通過Western blot實驗證實，LY294002可以成功干預Akt通路活性[7]。實驗結(jié)果顯示，丙泊酚可減輕大鼠腦缺血后的神經(jīng)功能障礙、腦梗死體積和腦水腫，這些結(jié)果表明丙泊酚對缺血性腦損傷具有腦保護作用。而腦室內(nèi)注射LY294002可抑制丙泊酚對缺血性腦損傷的神經(jīng)保護作用，證實PI3K/Akt信號通路在丙泊酚對腦缺血的神經(jīng)保護作用中起重要的調(diào)節(jié)作用。

檢測大鼠腦MPO可判定腦組織中性粒細胞的浸潤程度，也反映了腦組織的局部炎癥反應[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可抑制大鼠缺血腦組織炎性細胞的浸潤，而這一作用被腦室內(nèi)注射LY294002所抑制，說明丙泊酚通過激活PI3K/Akt信號通路減輕腦缺血誘導的局部炎癥反應，PI3K/Akt信號通路在丙泊酚減輕腦缺血炎癥反應過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

我們進一步用Western blot方法檢測了信號通路關鍵蛋白p-Akt和Akt的表達，結(jié)果顯示，大鼠腦缺血24 h缺血腦組織p-Akt的表達下降，丙泊酚上調(diào)p-Akt的表達，丙泊酚對p-Akt的上調(diào)作用被腦室內(nèi)注射LY294002抑制；但是各實驗組之間總Akt的蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。以上實驗數(shù)據(jù)表明，腦室內(nèi)注射LY294002可抑制大鼠缺血性腦損傷PI3K/Akt信號通路的活化，PI3K/Akt信號通路在丙泊酚對腦缺血的抗炎癥作用和神經(jīng)保護作用過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

TNF-α和IL-1β是促炎癥細胞因子，可通過促進炎癥反應，加重缺血性腦損傷的病理生理過程[9-10]。在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血腦損傷中，丙泊酚被證實可抑制TNF-α和IL-1β的表達，從而抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血性腦損傷，起神經(jīng)保護作用[11]。在本實驗中，大鼠腦缺血24 h血漿中TNF-α和IL-1β的水平升高，丙泊酚抑制TNF-α和IL-1β的表達，丙泊酚的這種作用被腦室內(nèi)注射LY294002所抑制，表明丙泊酚通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗炎癥作用。綜上所述，PI3K/Akt信號通路在丙泊酚減輕缺血性腦損傷和腦缺血炎癥反應過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。