阿地力江·薩吾提，艾尼瓦爾·吾買爾，買爾旦·玉蘇甫，吉米麗汗·司馬依，阿布來提·阿布力孜,艾合麥提江·納曼，艾再提·克熱木，周文婷

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的日益發(fā)展與深入研究，人們開始逐漸認識到疾病治療需要干預(yù)多個靶點和多條信號通路。中醫(yī)藥治療疾病具有整體觀和辨證論治的特點,而且在治療復(fù)雜疾病方面顯示出了更好的預(yù)期效果。中藥及其復(fù)方具有多成分、多靶點協(xié)同作用的特點，這種復(fù)雜特征成為解釋中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制的一個瓶頸。因此，天然藥物主要有效成分的多靶點研究和配伍研究，成為新一代藥物研究的熱點。

羅勒(OcimumbasilicumL.)為唇形科羅勒屬，1年生草本植物。味辛、性溫，其全草部分和種子均可入藥，具有疏風(fēng)解表、解毒消腫、強心安神、化濕和中、消散瘀腫、行氣活血、止痛等功效[1]。在我國主要生長在新疆、四川、云南等地。化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、酚酸，黃酮、甾體類化合物。眾多研究表明[2]，羅勒水提物或醇提物有細胞毒性、清除自由基、抗炎、抗腫瘤、抗菌/抗毒、降血脂、抗動脈粥樣硬化等藥理作用。雖然羅勒藥理作用豐富，其作用機制尚未完全闡明，為此，系統(tǒng)揭示羅勒主要活性成分及其藥理作用機制具有重要意義。

近年來，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究天然藥物越發(fā)被人們關(guān)注。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體的角度研究藥物與疾病間的聯(lián)系，將藥物-靶點網(wǎng)絡(luò)與生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，基于系統(tǒng)生物學(xué)，聯(lián)合應(yīng)用多向藥理學(xué)、生物分析等多種學(xué)科，經(jīng)過不同網(wǎng)絡(luò)模型的可視化表達，闡明中草藥的藥理學(xué)性質(zhì)。這種新方法特別適合用于反映天然藥物的多成分-多靶點的作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一概念的提出，突破了單一靶點作用于單一疾病的思想限制，為研究中藥及其復(fù)方中的潛在活性成分和作用靶點，提供了有效的研究策略[3]。本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及公開的文獻報道為基礎(chǔ)，利用多種數(shù)據(jù)庫資源，系統(tǒng)研究了羅勒揮發(fā)油的活性成分、治療疾病的靶點及其主要作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料PubChem(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)、DrugBank (https://www.drugbank.ca/)等數(shù)據(jù)庫，獲取羅勒揮發(fā)油成分規(guī)范化的三維分子結(jié)構(gòu)描述符，SIB(https://www.sib.swiss/)數(shù)據(jù)庫檢索出揮發(fā)油成分的藥動學(xué)參數(shù)及靶點信息，根據(jù)UniProt(http://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫中的靶點信息作為統(tǒng)一標準，利用治療靶點(therapeutic target disease，TTD, https://db.idrblab.org/ttd/)數(shù)據(jù)庫，檢索疾病靶點，經(jīng)KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG，http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫，檢索出預(yù)測靶點對應(yīng)的疾病靶點通路。

1.2 成分收集及整理羅勒揮發(fā)油化學(xué)成分的收集按照以下幾個標準進行：① 通過文獻已經(jīng)公開報道的新疆地區(qū)羅勒揮發(fā)油成分；② 羅勒中已經(jīng)定量的揮發(fā)油化學(xué)成分。對收集到的成分進行預(yù)處理及標準化，去除離群樣本和多余的分子描述，最終將成分名稱輸入PubChem數(shù)據(jù)庫，檢索出規(guī)范化的三維分子結(jié)構(gòu)描述符，用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

1.3 活性成分的篩選按照上述標準整理到的羅勒揮發(fā)油規(guī)范化的三維分子結(jié)構(gòu)描述符，輸入到SIB(http://www.swissadme.ch)數(shù)據(jù)庫中，導(dǎo)出化學(xué)成分相關(guān)的藥動學(xué)參數(shù)，根據(jù)ADME參數(shù)選出具有生物活性的成分，進一步研究。

1.4 成分靶點預(yù)測預(yù)測到的活性成分，按照同樣的方法在Swiss Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)中檢索，獲取成分靶點，并利用UniProtKB (http://www.uniprot.org/)核對靶點信息、篩選并整理，利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行靶點蛋白的富集分析。

1.5 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建收集到的活性成分及對應(yīng)的預(yù)測靶點輸入到Cytoscape6.0網(wǎng)絡(luò)可視化軟件中，構(gòu)建成分-靶點(compound-target，C-T)網(wǎng)絡(luò)，基于邊數(shù)、節(jié)點、關(guān)聯(lián)性設(shè)置顏色、大小。

1.6 疾病靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建活性成分預(yù)測到的靶點，利用治療靶點疾病數(shù)據(jù)庫TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)、KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.genome.jp/kegg/)等檢索平臺，獲取其相關(guān)的疾病靶點及靶點通路信息，進行整理。

2 結(jié)果

按照成分收集標準，在已經(jīng)公開的文獻報道中整理出了134個羅勒揮發(fā)油成分，對這些成分進一步研究。

2.1 成分篩選標準及結(jié)果口服生物利用度(oral bioavailability，OB)是藥物吸收、分布、代謝、排泄(absorption,distribution,metabolism,excretion，ADME)特性中尤為重要的參數(shù)之一，它表示單位口服劑量產(chǎn)生藥效的百分數(shù)，在Swiss中，胃腸道吸收的高低被用來指示口服生物利用度。較高的OB值是表明藥效分子及類藥性的關(guān)鍵指數(shù)。藥效可以影響ADME過程，因而導(dǎo)致藥物生物利用度的變化[4]。細胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)和P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)均能在胃腸道中高度表達，且兩者的底物能夠相互重疊，因此，腸道細胞CYP450 對已吸收藥物的生物轉(zhuǎn)化作用和腸道細胞中P-gp對已吸收藥物的主動外排作用是影響OB的重要因素[5]。影響藥物生物利用度的這些同工酶的抑制，進一步影響了藥物-藥物相互作用，藥物或其代謝物在體內(nèi)累積，進一步導(dǎo)致了藥物的毒性或其他不良反應(yīng)。Swiss ADME中CYP450及P-gp作為界定OB的參數(shù)，進一步提高了數(shù)據(jù)的可靠性。

質(zhì)量高的化合物應(yīng)該具備一些良好的化合物特性，其中包括類藥性(drug-likenesses，DL)。DL是指有良好的臨床療效藥物的物理化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)特性(包括ADME/Tox)。Lipinski指出,類藥化合物系具有足以被人體接受的ADME特性和安全性，在I期臨床試驗結(jié)束后，待進行下一步實驗的化合物[6]。從生物學(xué)角度看，DL總和了藥代動力學(xué)性質(zhì)與藥物的安全性。Swiss ADME提供了5種不同規(guī)則的藥物相似性指標(Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge)。在活性成分的篩選中，我們選擇了典型的Lipinski五項原則作為活性成分的篩選標準。

最初按照標準，從文獻[7-11]來源的134個羅勒揮發(fā)油成分，從PubChem等數(shù)據(jù)庫獲取其規(guī)范化的三維分子結(jié)構(gòu)描述符，經(jīng)Swiss ADME獲取相關(guān)的化學(xué)成分參數(shù)，根據(jù)藥動學(xué)參數(shù)中OB與DL篩選活性成分，最終從134個揮發(fā)油中篩選出了6個有生物活性的成分(Tab 1)。這些成分分別為棕櫚酸(hexadecanoic acid，含量為0.7)、十六酸甲酯(methyl hexadecanoate，含量為0.5)、9,12-十八碳二烯甲酯(9,12-octadecadienoic acid，含量為0.1)、亞麻酸(linolenic acid，含量為13.83)、亞麻酸甲酯(linoleic acid methyl ester，含量為0.32)、6,10,14-三甲基十五烷-2-酮(6,10,14-trimethylpentadecane-2-one，含量為0.09)，均表現(xiàn)為高胃腸道吸收、高類藥性和較高的生物利用度。

Tab 1 Active ingredients of essential oil of Ocimum basilicum L.

*Lipinski's rule of five also known as the Pfizer′s rule of five or simply the rule of five(RO5), including the rule of MW≤500, MLOGP≤4.5, N or O≤10, NH or OH≤5; All of these six active ingredients were violated by MLOGP>4.15 respectively.

2.2 蛋白預(yù)測結(jié)果與分析具有生物活性的生物小分子與蛋白質(zhì)或其他大分子結(jié)合，從而調(diào)節(jié)其活性[12]。因此，預(yù)測有生物活性小分子的靶標是揭示其藥物活性，以及預(yù)測其潛在的副作用或交叉反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。Swiss Target Prediction是通過二維和三維結(jié)構(gòu)的相似性，來測量成分與已知配體的組合，準確預(yù)測分子靶點的一個免費的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫是通過已知配體的2D和3D結(jié)構(gòu)相似性，來預(yù)測出待測成分的作用靶點。對活性成分進行靶點預(yù)測，最終得到了6個活性成分相對應(yīng)的91個蛋白靶點。將這些靶點進行整理，最終獲取了與人類同源性的25個不同的相關(guān)蛋白靶點(Tab 2)，這些預(yù)測到的靶點蛋白經(jīng)UniProt進行核對并統(tǒng)一。

2.3 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)結(jié)果與分析6個活性成分及其相對應(yīng)的25個蛋白靶點，分別以節(jié)點、靶點輸入到網(wǎng)絡(luò)可視化軟件CytoScape6.0中，得到C-T網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 1)，有31個節(jié)點，47個邊緣，其中六邊形的節(jié)點表示6個活性成分，青色圓表示該成分對應(yīng)的靶點。由Fig 1可以看出，靶點碳酸酐酶(carbonic anhydrase)亞型CA5A、CA7、CA3、CA5B、CA13在化合物十六酸甲酯和6,10,14-三甲基十五烷酮中均被預(yù)測到，脂氧合酶(lipoxygenase family)亞型ALOX12B、ALOX12、ALOX15、ALOXE3和ALOX15均在亞麻酸甲酯和9,12-十八碳二烯甲酯中作為共有的靶點蛋白。MBNL2和MBNL3對應(yīng)于十六酸甲酯和棕櫚酸中,大腦中的脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding protein)FABP7出現(xiàn)在亞麻酸、棕櫚酸和9,12-十八碳二烯甲酯的交集中，過氧化物酶體增殖物激活受體-δ(peroxisome proliferator-activated receptor delta，PPARD)交集在亞麻酸、亞麻酸甲酯和9,12-十八碳二烯甲酯中。C-T網(wǎng)絡(luò)表明，PPARD、PPARA、CA5A、CA7、CA3、CA5B、CA13、ALOX12B、ALOX12、ALOX15、ALOXE3是羅勒揮發(fā)油成分的主要作用靶點。將這些靶點信息利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行功能富集分析，選擇P<0.01，結(jié)果顯示這些預(yù)測靶點蛋白可能主要參與亞油酸代謝過程、脂氧合酶途徑、花生四烯酸代謝過程、糖代謝過程、脂氧素A4生物合成過程、hepoxilin生物合成過程、建立皮膚屏障、細胞-基質(zhì)黏附的正調(diào)節(jié)、傷口愈合、調(diào)節(jié)凋亡細胞的吞噬、適應(yīng)性免疫反應(yīng)的負調(diào)控、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路的調(diào)節(jié)、對白細胞介素-13的反應(yīng)、磷脂酰乙醇胺生物合成等過程。

2.4 靶點-通路結(jié)果與分析預(yù)測到的48個靶點，通過整理和刪除重復(fù)后，經(jīng)TTD、KEEG等數(shù)據(jù)庫獲取其對應(yīng)的疾病靶點及通路信息，經(jīng)整理得到19個不同的作用通路(Tab 3)。結(jié)果顯示，這些靶點主要是通過5-羥色胺突觸(serotonergic synapse)信號通路、PPAR信號通路(PPAR signaling pathway)、代謝途徑信號通路(metabolic pathways)、花生四烯酸代謝信號通路(arachidonic acid metabolism)等信號通路。

Fig 1 Active components of basil and their corresponding targets(compound-target, C-T) network

The pink hexagon represents the six active ingredients in basil essential oil, and 25 cyan-blue circles represent the predicted target corresponding to the component.

Tab 3 Predicted signaling pathway based on active ingredient-target

將這些靶點與化學(xué)成分相互聯(lián)系，用Cytoscape6.0構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)(compound-target-pathway)圖(Fig 2)，這些靶點與信號通路還原到DAVID數(shù)據(jù)庫中進行通路分析，選擇P<0.05，結(jié)果預(yù)測靶點中描述的主要信號通路一致。

3 討論

自從2007年 Hopkin提出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念以來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)開始用于闡釋中草藥藥效作用機制，突破了單個成分治療單一疾病的局限。天然產(chǎn)物具有復(fù)雜的生物學(xué)活性，在中醫(yī)藥領(lǐng)域中，常用于疾病治療，其獨特的生物活性表現(xiàn)在中草藥與生物體的作用特殊且較為復(fù)雜,進入人體后的作用途徑與方式各有差異，有的直接作用于特定靶點，有的經(jīng)代謝后產(chǎn)生新的產(chǎn)物，再作用于特定靶點, 還有的通過調(diào)控內(nèi)源性物質(zhì)間接發(fā)揮作用,或作用于不同的多個靶點，并發(fā)生協(xié)同作用等。

羅勒是在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用歷史悠久的藥材之一，常用其干燥的全草和干燥的果實。近年來，隨著羅勒水提物研究的不斷深入，明確指出羅勒水提物有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗血栓等藥理活性。臨床上羅勒是治療心腦血管疾病的首選藥材之一。作為天然藥物，羅勒化學(xué)成分多、藥理作用復(fù)雜，用于疾病的作用機制尚未完全闡明。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，系統(tǒng)地闡述了羅勒揮發(fā)油中的活性成分，對活性成分預(yù)測出的蛋白靶點進行富集分析，結(jié)合信號通路描述了成分與作用靶點之間的直接聯(lián)系。結(jié)果表明，羅勒揮發(fā)油成分中的亞油酸、亞麻酸甲酯、9,12-十八碳二烯甲酯等揮發(fā)油活性成分的作用靶點對應(yīng)不同的信號通路，相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)節(jié)，主要通過脂氧合酶(lipoxygenase family)亞型ALOX15、ALOX12、PTGS1、PPARD、PPARA等靶點，通過5-羥色胺突觸信號通路、PPAR信號通路、代謝途徑信號通路、花生四烯酸代謝信號通路等，共同作用于心血管疾病、神經(jīng)性疾病等不同疾病，從不同角度揭示了活性成分的主要作用靶點和作用于疾病的主要途徑。Magnusson等[13]通過實驗驗證了在缺氧狀態(tài)下，心肌細胞、頸動脈斑塊中ALOX15的表達均有增加。我們的研究結(jié)果表明，羅勒揮發(fā)油中活性成分可能通過花生四烯酸代謝途徑作用于ALOX15，從而治療缺血性心臟病、動脈粥樣硬化等疾病。Levi等[14]研究結(jié)果表明，F(xiàn)ABP5是乳腺癌細胞增長的關(guān)鍵因素。我們的研究結(jié)果表明，羅勒揮發(fā)油中的有效成分亞油酸能夠與FABP5結(jié)合，從而通過PPAR信號通路作用于乳腺癌細胞的增殖。研究證明，亞油酸誘導(dǎo)乳腺上皮細胞中肌成束蛋白表達的增加，亞油酸通過癌細胞中的肌成束蛋白依賴途徑，促進癌細胞的遷移、侵襲和MMP-9分泌[15]。本研究結(jié)果吻合了亞油酸抑制癌細胞的增殖、遷移和促進凋亡的實驗結(jié)果，進一步可以從亞油酸是否通過FABP5與PPAR信號通路，來抑制腫瘤細胞的增殖與遷移的生物學(xué)驗證進行研究。除了上述以外，這些成分靶點與信號通路可以用于治療高脂蛋白血癥、2型糖尿病、遺傳性肥胖、早期嬰兒型癲癇性腦病、抑郁癥、先天性魚鱗癬等皮膚病、神經(jīng)系統(tǒng)障礙性疾病、心血管疾病、癌癥、碳酸酐酶VA缺乏致高氨血癥等疾病。通過對羅勒揮發(fā)油活性成分-多靶點-通路的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，羅勒揮發(fā)油中的多個活性成分作用于不同的靶點，經(jīng)不同途徑作用于多種疾病，呈現(xiàn)出天然產(chǎn)物的多成分、多靶點相互調(diào)節(jié)，發(fā)揮“異病同治”的特點。更能清楚地解釋羅勒總提取物中的具體成分經(jīng)某一靶點治療疾病的作用機制，在藥物研發(fā)中為藥物成分的入選提供了佐證。

Fig 2 Essential active components of basil volatile oil-target-pathway

Purple hexagons indicate active ingredients of volatile oil, blue circles indicate component targets, and red triangles indicate signal pathways for the role of major targets.

本研究結(jié)果與先前研究的羅勒提取物的藥理作用相吻合，說明預(yù)測靶點的準確性。此外，對于上述靶點以外的潛在靶點，相關(guān)文獻研究報道較少，為今后對羅勒活性成分及其作用機制的研究提供了線索。