艾麗雅 楊利娟 劉俊彤 敖其爾 賽音朝克圖

[摘要] 目的 觀察蒙醫(yī)不同針刺法對抑郁大鼠前額葉神經(jīng)遞質(zhì)及蛋白激酶（PKA）活性、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）磷酸化和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）表達(dá)，探究蒙醫(yī)不同針法的抗抑郁作用機(jī)制。 方法 將40只雄性Sprague-Dawley大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、蒙醫(yī)銀針組、蒙醫(yī)三根平衡針組和藥物組，每組8只。除空白組外其他組大鼠孤養(yǎng)并給予不可預(yù)知的7種不同的應(yīng)激刺激28 d。其中空白組每籠飼養(yǎng)4只，正常飲水?dāng)z食，不給任何刺激;模型組不給予任何治療;蒙醫(yī)銀針組于每日接受應(yīng)激刺激前1 h，進(jìn)行蒙醫(yī)銀針刺激巴達(dá)干穴、心穴和黑白際穴;蒙醫(yī)三根平衡針組的針刺和選穴同蒙醫(yī)銀針組，但每日選取1個(gè)穴位給予溫針刺激;藥物組于每日進(jìn)行應(yīng)激刺激前1 h，將鹽酸氟西汀以0.9%氯化鈉溶液配制成1 mg/mL，按照2 mg/kg體重，灌胃給藥。28 d后斷頭，取大鼠前額葉，采用酶聯(lián)免疫吸附法和Western blot法檢測5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）含量，PKA活性，CREB磷酸化和BDNF表達(dá)水平。 結(jié)果 與空白組比較，造模28 d后模型組大鼠前額葉5-HT、NE、DA含量顯著降低（P < 0.01），PKA活性、CREB和BDNF表達(dá)水平也明顯下降（P < 0.05）。與模型組比較，蒙醫(yī)三根平衡針組、藥物組大鼠前額葉NE、DA和5-HT的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），蒙醫(yī)銀針組大鼠前額葉DA和5-HT的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與模型組比較，蒙醫(yī)銀針組、蒙醫(yī)三根平衡針組和藥物組大鼠前額PKA活性、CREB和BDNF表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 蒙醫(yī)不同針法能有效提高5-HT、NE、DA含量、PKA活性及CREB-BDNF的表達(dá)，提示蒙醫(yī)不同針法均有抗抑郁作用。

[關(guān)鍵詞] 蒙醫(yī);針刺;抑郁癥;單胺類神經(jīng)遞質(zhì);PKA/CREB/BDNF通路

[中圖分類號] R749.4;R245? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（b）-0009-05

抑郁癥是以持續(xù)的情緒低落為主要特征的精神障礙。目前對于抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚不完全明了。很多研究數(shù)據(jù)顯示，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在腦內(nèi)的含量水平與抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)[1-2]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）參與促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育、分化、再生等一系列生物學(xué)效應(yīng)[3]。在抑郁動(dòng)物模型中，大腦海馬和前額葉皮質(zhì)內(nèi)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）和BDNF表達(dá)異常[4]。而且抑郁癥患者BDNF水平與漢密爾頓抑郁量表（HAMD）得分呈負(fù)相關(guān)[5]。BDNF能促進(jìn)5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）能神經(jīng)元的再生和發(fā)芽，促進(jìn)前額葉、海馬神經(jīng)元的生成[6]。因此，本研究觀察蒙醫(yī)不同針刺法對抑郁模型大鼠前額葉蛋白激酶A（PKA）活性、CREB磷酸化、BDNF表達(dá)及5-HT、去甲腎上腺素（NE）、DA含量的影響，探究蒙醫(yī)不同針法的抗抑郁作用機(jī)制，同時(shí)可進(jìn)一步闡釋PKA/CREB/BDNF信號通路在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取清潔級Sprague-Dawley雄性大鼠40只，1.5～2.0月齡，體重（220±10）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SYXX（京）2012-0001，于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)均在屏障系統(tǒng)下進(jìn)行。大鼠可自由進(jìn)水和進(jìn)食以適應(yīng)環(huán)境，飼養(yǎng)7 d，而后測量體重，同時(shí)采用開野試驗(yàn)、糖水試驗(yàn)等進(jìn)行行為學(xué)檢測，通過開野試驗(yàn)剔除過于活躍和安靜的大鼠，留下適合條件的40只大鼠，并將其按照隨機(jī)數(shù)字表法分為五組（空白組、模型組、蒙醫(yī)銀針組、蒙醫(yī)三根平衡針組和藥物組），每組8只。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器? 電泳儀（美國Bio-Rad公司）;水平脫色搖床（江蘇其林貝爾公司）;ABI7500熒光定量PCR（Applied Biosystems公司）;蒙醫(yī)RZ-Ⅰ型電熱銀針治療儀（內(nèi)蒙古元陽中蒙醫(yī)科技開發(fā)有限公司）;溫冷凍離心機(jī)及MultiSkan3酶標(biāo)儀均購于美國Thermo公司。

1.2.2 試劑? 鹽酸氟西汀膠囊（百憂解，20 mg×28粒，禮來蘇州制藥有限公司）;5-HT（美國Sigma公司，批號：114K7028）;DA、NE（中國食品藥品檢定研究院，批號：100070-201006、100169-21103）;CREB抗體（美國CST公司）;BDNF抗體（美國Santa公司）;山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG（北京天德悅公司）;β-actin鼠單抗（美國Immunoway公司）。

1.3 造模與干預(yù)方法

1.3.1 造模方法? 依照文獻(xiàn)[7-8]，造模大鼠全部孤養(yǎng)，并且在28 d內(nèi)隨機(jī)進(jìn)行4℃冷水游泳5 min、晝夜顛倒24 h、禁食24 h、禁水24 h、夾尾3 min、水平搖晃30 min、潮濕環(huán)境24 h等7種不同應(yīng)激刺激。每天進(jìn)行1種刺激，但同一種刺激不可連續(xù)重復(fù)出現(xiàn)，每種刺激最少可進(jìn)行3次。經(jīng)過28 d造模后通過行為學(xué)（開野試驗(yàn)、糖水試驗(yàn)）及體重檢測證明慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠造模成功。

1.3.2 干預(yù)方法? 空白組大鼠合籠飼養(yǎng)，其他各組大鼠均孤養(yǎng)?？瞻捉M：正常飲水?dāng)z食，不給予任何刺激。模型組：接受7種不同的應(yīng)激刺激。蒙醫(yī)銀針組：每天接受應(yīng)激刺激前1 h，進(jìn)行蒙醫(yī)銀針（銀針長度3 cm、直徑0.65 mm）刺激巴達(dá)干穴、心穴、黑白際穴。每次留針時(shí)間為20 min，并且針刺時(shí)巴達(dá)干穴、心穴針尖向上斜刺0.8 cm，黑白際穴針尖向下斜刺0.8 cm。蒙醫(yī)三根平衡針組：針刺和選穴同蒙醫(yī)銀針組，但每日取1個(gè)穴位，并且針柄連接蒙醫(yī)RZ-Ⅰ型電熱銀針治療儀加溫刺激（溫度40～42℃），每次加溫20 min。以第1天巴達(dá)干穴、第2天心穴、第3天黑白際穴為加溫循序依次循環(huán)刺激。藥物組：在每天接受應(yīng)激刺激前1 h，把鹽酸氟西?。ò賾n解）以0.9%氯化鈉溶液配制成1 mg/mL，按2 mg/kg體重灌胃給藥。每組干預(yù)方法都進(jìn)行28 d。注：巴達(dá)干穴位于第三胸椎下凹正中，心穴位于第7胸椎下凹正中，黑白際穴位于前正中線，兩乳正中的心窩處。

1.4 觀察指標(biāo)

行為學(xué)檢測全部完成后對大鼠進(jìn)行開胸腔，暴露心臟，先用0.9%氯化鈉溶液灌流10 min，而后用4%甲醛急灌10 min，慢灌20 min。斷頭取腦，除去顱骨，在冰袋上迅速取出海馬，取下額葉，稱重，放置速凍管，液氮速凍，并保存于-80℃超低溫冰箱待測。上述操作均在冰盤上3 min內(nèi)完成。利用酶聯(lián)免疫吸附法按照試劑盒操作說明測試前額葉5-HT、DA、NE表達(dá)水平，利用Western blot法檢測PKA活性、CREB和BDNF表達(dá)水平。用BCA法提取組織蛋白，以β-actin（分子量為42 kD）作為內(nèi)參照，用Total Lab Quant軟件圖像分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，所有檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。若各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，且數(shù)據(jù)方差齊，則采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);若數(shù)據(jù)非正態(tài)分布或方差不齊，可采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蒙醫(yī)不同針法對抑郁大鼠前額葉皮質(zhì)5-HT、DA、NE含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠前額葉NE、DA和5-HT含量顯著降低（P < 0.01）;與模型組比較，蒙醫(yī)三根平衡針組、藥物組大鼠前額葉NE、DA和5-HT的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;與模型組比較，蒙醫(yī)銀針組大鼠前額葉DA和5-HT的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠前額葉PKA活性、CREB和BDNF表達(dá)水平比較

2.2.1 蒙醫(yī)不同針法對抑郁大鼠前額葉PKA活性的影響? Western blot結(jié)果顯示，與空白組比較，模型大鼠前額葉PKA活性明顯降低（P < 0.01）;與模型組比較，蒙醫(yī)銀針組、蒙醫(yī)三根平衡針組、藥物組大鼠前額葉PKA活性顯著升高（P < 0.05）。

2.2.2 蒙醫(yī)不同針法對大鼠前額葉CREB和BDNF表達(dá)的影響? Western blot檢測顯示，與空白組比較，模型組大鼠前額葉CREB和BDNF表達(dá)降低（P < 0.01）;與模型組比較，蒙醫(yī)銀針組、蒙醫(yī)三根平衡針組、藥物組大鼠前額葉CREB和BDNF表達(dá)上升（P < 0.05）。

3 討論

慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型是抗抑郁藥物評價(jià)應(yīng)用最廣泛的模型。在前期研究工作中發(fā)現(xiàn)，給予慢性應(yīng)激刺激后模型組大鼠活動(dòng)減少，探索興趣降低[9]，證明造模成功。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失衡假說在抑郁癥治療和發(fā)病機(jī)制研究中起重要作用[10]。本研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠額葉5-HT、NE、DA含量明顯降低（P < 0.01），蒙醫(yī)不同針刺法均能提高抑郁大鼠額葉5-HT、NE、DA含量。證實(shí)了腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)失衡與抑郁發(fā)生密切相關(guān)的假說。多項(xiàng)研究顯示，CREB-BDNF通路廣泛參與抑郁癥的發(fā)生。CREB是一種轉(zhuǎn)錄因子，其在蛋白家族激活后主要的功能是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[11-12]。cAMP通過PKA使其下游靶標(biāo)CREB的Ser133點(diǎn)位發(fā)生磷酸化[13]，磷酸化的CREB與細(xì)胞核內(nèi)的環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合因子特異性結(jié)合后誘導(dǎo)相應(yīng)的基因表達(dá)[14]。BDNF是CREB的經(jīng)典下游靶基因[15]，cAMP通過激活PKA，使CREB磷酸化，從而促進(jìn)BDNF基因表達(dá)[16-17]。抑郁癥患者海馬、前額葉和血清BDNF含量明顯下降，給予抗抑郁藥物治療能夠增加BDNF的表達(dá)[18-19]。

本研究結(jié)果顯示，給予慢性應(yīng)激刺激28 d后PKA活性及CREB和BDNF表達(dá)明顯下降。蒙醫(yī)銀針組、蒙醫(yī)三根平衡針組和藥物組的PKA活性及CREB和BDNF表達(dá)水平均高于模型組。提示慢性應(yīng)激抑制PKA活性及CREB和BDNF的表達(dá)，抗抑郁治療能夠改善PKA活性以及CREB和BDNF的表達(dá)。提示蒙醫(yī)不同的抗抑郁針刺法均對PKA的激活、CREB和BDNF基因表達(dá)具有明顯的促進(jìn)作用。

研究表明，5-HT神經(jīng)傳遞和BDNF水平都可以增加抑郁易感性[20]。BDNF能促使5-HT神經(jīng)元的存活以及分化，5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)也可刺激BDNF的表達(dá)[21]。但是由于促進(jìn)5-HT/NE/DA膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的相關(guān)調(diào)控分子比較復(fù)雜，而且抑郁的發(fā)生依賴于基因、心理、環(huán)境等多種復(fù)雜因素的交互作用，而不是單一、簡單清晰的發(fā)病機(jī)制，BDNF以外的其他基因也有可能參與調(diào)節(jié)5-HT系統(tǒng)的失衡。故5-HT/NE/DA系統(tǒng)和BDNF信號通路對抑郁癥的調(diào)節(jié)作用和生理功能所產(chǎn)生的影響仍待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-08-15? 本文編輯：張瑜杰）