王麟 鄭敏

【摘 要】 目前國內(nèi)外對(duì)乙型肝炎病毒的不斷研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒基因型分布存在地理差異與肝病的發(fā)生、發(fā)展以及抗病毒藥物的療效都有一定的相關(guān)性。本文針對(duì)乙型肝炎病毒（HBV）生物學(xué)特征和流行病學(xué)特點(diǎn)對(duì)當(dāng)前各種HBV基因型分型技術(shù)方法的優(yōu)缺點(diǎn)等相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

【關(guān)鍵詞】 乙型肝炎病毒；基因分型技術(shù)；綜述

【中圖分類號(hào)】

R446.61 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】

A 【文章編號(hào)】1005-0019（2019）07-285-01

乙型病毒性肝炎是感染了乙型肝炎病毒（HBV）后引發(fā)的一種疾病。其中HBV病毒作為一種嗜肝病毒，對(duì)于人體的肝細(xì)胞會(huì)造成比較大的損害，引發(fā)肝細(xì)胞炎癥、壞死跟纖維化，并會(huì)直接危及到患者的生命健康安全。乙型病毒性肝炎作為全球范圍內(nèi)的一種傳染病疾病，目前已經(jīng)有超過20億人感染過HBV，每年也越有60萬人因?yàn)槁曰蛘呒毙砸倚透窝锥劳觯覈且腋尾《靖腥敬髧?，每年新發(fā)病人約有900萬人。近年來，隨著分子生物技術(shù)迅猛發(fā)展，人們對(duì)HBV認(rèn)識(shí)的不斷深入，通過對(duì)HBV基因分型，有利于更加深入細(xì)致地對(duì)HBV感染的流行病學(xué)、病因?qū)W及臨床診治研究。

1 乙型肝炎病毒生物學(xué)特征

據(jù)研究，HBV屬嗜肝DNA 病毒科，其核酸為部分雙鏈閉合環(huán)狀DNA。由一條較長(zhǎng)且長(zhǎng)度固定的負(fù)鏈和一條短的長(zhǎng)度不定的正鏈組成，是目前己知感染人類最小的DNA病毒。長(zhǎng)鏈稱為負(fù)鏈，它攜帶有病毒全部的編碼信息；短鏈稱為正鏈，大約是負(fù)鏈的50%-100%.大約有3182-3221個(gè)核苷酸組成病毒基因組。其中HBV DNA負(fù)鏈劃分為4個(gè)開放讀碼框（ORF），即⑴S-ORF是乙肝表面抗原（S）所在部位，由S、Pre-S1和Pre-S2 3個(gè)區(qū)域組成，編碼大、中、小3種胞膜蛋白；⑵C-ORF分為pre-C和C區(qū)是病毒感染性的決定部位，編碼HBeAg和HbcAg曲段具備有高免疫原性，也是免疫攻擊靶標(biāo)的位置；⑶P-ORF 是最長(zhǎng)的閱讀框和S-ORF、C-ORF、X-ORF重疊，是P蛋白（即HBV-DNA多聚酶）病毒復(fù)制的主要功能單位；⑷X-ORF編碼HBx蛋白作為一種多功能反式調(diào)節(jié)因素，還有著增強(qiáng)子跟啟動(dòng)子兩者的轉(zhuǎn)錄功能，與HBV感染導(dǎo)致的肝細(xì)胞癌變密切相關(guān)。

2 HBV基因型的分子流行病學(xué)

HBV基因型有著一定的地理區(qū)域性特點(diǎn)，在不同區(qū)域中的流行以及傳播方式也有著比較大的差異。因此在進(jìn)行HBV自然感染史發(fā)生跟變異特點(diǎn)的研究過程中，也就可以通過不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)基因型來進(jìn)行，對(duì)于南亞及琉球群島等地區(qū)的BBV主要基因型分布情況進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。

3 HBV基因型對(duì)抗病毒藥物使用的影響

抗病毒治療的成效既于感染者自身免疫情況有關(guān)，也于病毒基因型有關(guān)。HBV的各基因區(qū)及多數(shù)調(diào)控序列中都可發(fā)生變異，HBV基因突變會(huì)產(chǎn)生病毒耐藥。臨床上經(jīng)常有因?yàn)椴煌瑓^(qū)域的HBV變異所導(dǎo)致的免疫逃逸性跟致病性等問題出現(xiàn)，對(duì)于乙肝患者的診斷、治療跟防治工作也造成了比較大的阻礙?，F(xiàn)階段多是采用干擾素跟核苷酸類似物來進(jìn)行慢性乙型肝炎的治療，臨床應(yīng)用的主要有拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋、替比夫定。拉米夫定耐藥機(jī)制為HBV-DNA聚合酶基因突變引起病毒DNA與藥物結(jié)合力減弱突變部位有：rtM204I，rtM180M+rtM204V，rtL180M+rtM204I，rtV173L+rtL180M+rtM204V，其中最常見變異是rtM204V/I。阿德福韋是開鏈核苷酸類似物其耐藥位點(diǎn)是HBV聚合酶P區(qū)的rtA181T/V和rtN236T，其中rtN236T的變異較常見。恩替卡韋的變異位點(diǎn)在HBV聚合酶P區(qū)的rtT184G，rtS202I或rtM250V，其耐藥的機(jī)制可能是限制了恩替卡韋與HBV多聚酶的結(jié)合。替比夫定是較新上市的核苷類抗病毒藥物，屬于左旋核苷類似物，具有較拉米夫定更強(qiáng)的抑制HBV的活性，且耐藥發(fā)生率低，治療1年時(shí)僅5%出現(xiàn)變異。對(duì)于部分長(zhǎng)期服用核苷酸類藥物的患者，還要做好基因型跟耐藥突變位置的檢測(cè)工作，來對(duì)不同基因型乙肝患者的耐藥基因進(jìn)行分析，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行抗病毒藥物的針對(duì)性選擇。

4 HBV基因型分型技術(shù)的研究和發(fā)展

4.1 HBV全基因測(cè)序分型法 通過PCR擴(kuò)增HBV全基因DNA的方式，可以實(shí)現(xiàn)HBV的全基因測(cè)序，對(duì)于不同病毒株親緣關(guān)系以及型別的確定也有著積極意義。利用以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)的HBV基因分型處理工具，只需要輸入待分析序列就能夠查詢到結(jié)果，并且有著操作簡(jiǎn)單、信息量跟可靠性高的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。但是該測(cè)序方法的成本比較多，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)而且敏感度有限，不宜進(jìn)行大量標(biāo)本的流行病學(xué)研究。

4.2 PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）基因分型法 PCR-RFLP技術(shù)主要是PCR跟RFLP兩種技術(shù)的結(jié)合，在該測(cè)序技術(shù)中能夠使用來源于RCP擴(kuò)增目的片段在合適的限制性內(nèi)切酶水解作用中，采用瓊脂糖凝膠電泳來進(jìn)行處理，讓其在不同基因型片段中呈現(xiàn)出不同的條帶加以區(qū)分，該分型方法比較簡(jiǎn)便有效，還不需要對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行雜交跟測(cè)序處理，因此在流行病調(diào)查研究工作中獲得了良好的應(yīng)用效果。但是該分型方式只能夠?qū)ο拗泼感蛄袃?nèi)的圖片進(jìn)行識(shí)別，若限制酶的消化待測(cè)序列不切地或者遇到混合基因型的復(fù)雜條帶時(shí)，也就難以獲得良好的分型識(shí)別效果，此外還存在有參考序列過少以及圖譜復(fù)雜程度高的特征。

4.3 線性探針反向雜交基因分型法 此法是比利時(shí)Innogenetics公司發(fā)明，首先需要結(jié)合待測(cè)序列來進(jìn)行特異性線性探針的設(shè)計(jì)，隨后將其固化在支持物上面進(jìn)行PCR擴(kuò)增處理，隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物跟固相探針進(jìn)行反向雜交處理，顯色處理后就能夠獲得分型結(jié)果。此法可檢測(cè)單型感染也可檢測(cè)多型混合感染，是一種可信、便利、快速的方法。缺點(diǎn)是只能對(duì)已建立的基因型進(jìn)行分型。

4.4 酶免疫測(cè)定基因型分型法（ELISA） 用辣根氧化物酶標(biāo)記對(duì)乙肝病毒前S2區(qū)（b、k、m、s、u、f、g）進(jìn)行特異性單克隆抗體的設(shè)計(jì)。應(yīng)用雙抗夾心法來進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以通過跟待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行表位組合的模式來進(jìn)行基因型的鑒定工作。該分型法操作簡(jiǎn)便，能夠在大樣本檢測(cè)中獲得良好的檢測(cè)效果。但是缺點(diǎn)是必須是HBV表面抗原陽性血清，對(duì)于混合型感染跟HBV表面抗原低水平表達(dá)的標(biāo)本也難以進(jìn)行有效鑒別。此外構(gòu)建抗前S2基因特異性表位的單克隆抗體還有著一定的難度，而且b、k、m、s和u表位有相應(yīng)基因型進(jìn)行充分的表達(dá)，但是f跟g表位在一些基因型上面還有著表達(dá)不充分的問題，因此在診斷過程中存在有一定的漏檢情況。

4.5 多重特異性引物PCR基因分型法 對(duì)HBV中的各型全序列以及目標(biāo)序列，隨后找出每種基因型相對(duì)于其它各型的獨(dú)特序列，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行針對(duì)各基因型獨(dú)特引物的合理設(shè)計(jì)。通過HBV基因型特異物對(duì)待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行PCR擴(kuò)增處理，采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行標(biāo)本鑒別處理。作為一種簡(jiǎn)單、快速以及高特異性的分型方法，HBV基因型特異性引物PCR分型法在臨床診斷以及大規(guī)模流行病學(xué)中也能夠獲得良好的應(yīng)用效果。缺點(diǎn)是單核苷酸多態(tài)性（SNP）酶切點(diǎn)可影響方法靈敏度，且檢測(cè)中有2.9%-4.5%的檢測(cè)不確定性。

4.6 反向斑點(diǎn)雜交基因分型法 此法是Saiki等提出的一種斑點(diǎn)雜交技術(shù)，該技術(shù)主要是針對(duì)各等位基因的特異性特診，在雜交基質(zhì)上進(jìn)行探針點(diǎn)的添加，隨后將標(biāo)本跟待測(cè)DNA樣品進(jìn)行雜交處理，這樣才能夠?qū)崿F(xiàn)待測(cè)樣本跟互補(bǔ)序列探針的有效結(jié)合。在對(duì)未結(jié)合的DNA進(jìn)行洗滌之后，對(duì)于特異性結(jié)合靶序列中的基因分型方法有著良好的檢測(cè)效果。該辦法有著快速簡(jiǎn)便、敏感度高以及特異性強(qiáng)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，在基因分型、基因突變檢測(cè)以及病原體檢測(cè)等多個(gè)方面也有著良好的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。缺點(diǎn)是可能會(huì)因基因組探針結(jié)合位點(diǎn)的多態(tài)性或缺失影響靈敏度。

4.7 核酸微孔芯片雜交基因分型法 是由Song等發(fā)明了一種可以檢測(cè)A-G型的低密度的核酸微孔芯片。先將病毒核酸的前S區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行標(biāo)記。擴(kuò)增后，加入到已固定型特異探針的硅烷化的玻片上，再與進(jìn)化樹及前S序列比對(duì)。用掃描設(shè)備檢測(cè)相應(yīng)的熒光信號(hào)的基因分型法。此法檢測(cè)單型或混型感染的樣本均有著不錯(cuò)的特異性和靈敏度。缺點(diǎn)是費(fèi)用昂貴，因基因組探針結(jié)合位點(diǎn)的多態(tài)性或缺失影響靈敏度。

4.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR-解離曲線基因分型法 將傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增和檢測(cè)結(jié)合，在同一個(gè)密閉容器中將PCR擴(kuò)增反應(yīng)與熒光標(biāo)記探針結(jié)合在一起，檢測(cè)目的核酸稱為“實(shí)時(shí)”PCR，當(dāng)PCR擴(kuò)增結(jié)束后，通過分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變化曲線進(jìn)行分型。實(shí)時(shí)熒光定量PCR-解離曲線技術(shù)能在很大程度上避免交叉污染，具備省時(shí)、高通量、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，也可檢測(cè)混合型基因感染。缺點(diǎn)是對(duì)PCR儀器性能要求較高且具有多色熒光的干擾；需完成多個(gè)型特異的PCR反應(yīng)；會(huì)因基因組引物、探針結(jié)合位點(diǎn)的多態(tài)性或缺失影響靈敏度。

5 HBV基因分型技術(shù)的應(yīng)用與展望

目前越來越多的研究表明，HBV基因型呈現(xiàn)明顯的域分布差異，大規(guī)模的系統(tǒng)流行病學(xué)分子特征普查將更有助于人們認(rèn)識(shí)不同基因型間的不同致病性對(duì)疾病演變、傳播方法和HBV與機(jī)體以及藥物的辯證關(guān)系，對(duì)指導(dǎo)抗病毒治療有著重要的意義。這依賴于簡(jiǎn)便快速的HBV基因分型方法。當(dāng)前HBV基因分類方法尚不完善，HBV基因型分類存在很多復(fù)雜因素。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過不斷探索研究，將會(huì)把HBV基因分型技術(shù)運(yùn)用到HBV臨床類型檢測(cè)、預(yù)后判斷及治療方法中，實(shí)現(xiàn)真正個(gè)體化用藥。

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