蔣彥潔

寄生在健康植物各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙中部分或全部生活周期的一類真菌被稱之為植物內(nèi)生真菌（Endophytefungus），其不會(huì)造成宿主明顯的病理癥狀[1]。根據(jù)內(nèi)共生理論，內(nèi)生真菌與宿主可能具有相同或相似的次生代謝產(chǎn)物[2]。由于許多具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物已從植物的內(nèi)生真菌中分離得到，再加上真菌的來源廣，從真菌切入，來開發(fā)抑菌及抗腫瘤藥物在當(dāng)前比較流行[3]。鐵皮石斛的抗腫瘤功效良好，部分品種還能起到殺蟲消炎效果[4]。另外，植物內(nèi)生真菌的分布和其生長地域密不可分。因此本項(xiàng)目通過分離浙江地理種源的鐵皮石斛中的內(nèi)生真菌，并篩選其抑菌及抗腫瘤活性，以期獲得高效低毒的抑菌抗腫瘤活性物質(zhì)。

1 供試材料與儀器

1.1 材料

野生鐵皮石斛采自浙江地理種源，大腸桿菌、枯草芽包桿菌、金色葡萄球菌、人胃癌MKN45細(xì)胞，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)提供。

1.2 試劑與儀器

PDA、MS、LB培養(yǎng)基，PBS緩沖液（pH值7.4），細(xì)胞凍存液；0.25%膜蛋白酶，0.02%EDTA購自杭州四季青公司；胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純：354型酶標(biāo)儀（生產(chǎn)商：Thermo公司）；IX70倒置相差顯微鏡（生產(chǎn)商：Olympus公司）。

2 研究方法

2.1 活性菌株的分離

內(nèi)生真菌的分離：將野生鐵皮石斛洗凈，并分別將根、莖、葉切成小片（0.5 cm），消毒方法參照嚴(yán)亮等[5]報(bào)道的方法。

2.2 抑菌活性篩選（抑菌實(shí)驗(yàn)）

指示菌培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)室自己培養(yǎng)，抗菌活性的初選應(yīng)用杯碟法、菌餅法、紙片法測定。而抑菌活性菌株的復(fù)選是通過紙片擴(kuò)散法來實(shí)現(xiàn)對活性菌株發(fā)酵液的抑菌活性的檢測。

2.3 抗腫瘤活性篩選

2.3.1 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與內(nèi)生真菌抗腫瘤活性的測定 采用體外細(xì)胞毒活性測定的MTT法測定菌體粗提物或發(fā)酵液粗提物的抗腫瘤活性。取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞。用胰蛋白酶消化后，用完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸浮液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，隨后取80 μL接種于96孔板，按每孔5 000～8 000個(gè)細(xì)胞接種，留兩孔做空白對照。置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，加入20 μL經(jīng)完全培養(yǎng)液稀釋的樣品（陰性對照組加20 μL培養(yǎng)液，空白組加入100 μL的培養(yǎng)液，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)），繼續(xù)培養(yǎng)2 d后取出，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入2.5 μg/μL的MTT溶液20 μL，37℃反應(yīng)4 h后，每孔再加100 μL DMSO，37℃溶解30 min；用酶標(biāo)儀測量各孔吸光值（測量波長為570 nm）并計(jì)算抑制率。

2.3.2 活性物質(zhì)對荷瘤小鼠抑瘤試驗(yàn) 將接種后的小鼠隨機(jī)分組，活性物質(zhì)設(shè)不同劑量以及生理鹽水組、陽性藥組，每組10～12只。之后繼續(xù)腹腔注射給藥（1次/d，共8 d），將小鼠的生存狀況和體質(zhì)量記錄下來。實(shí)體瘤模型實(shí)驗(yàn)組在最后給藥的第二天將其處死，剝離瘤塊稱其體質(zhì)量，并計(jì)算抑瘤率。

2.4 活性菌株的鑒定[6-7]

2.4.1 內(nèi)生真菌形態(tài)特征觀察 在顯微鏡下，觀察內(nèi)生真菌的菌落、菌絲和孢子等特征，參照《真菌鑒定手冊》和《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)真菌鑒定手冊》進(jìn)行鑒定。

2.4.2 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育分析 用真菌通用引物ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），經(jīng)PCR技術(shù)，擴(kuò)增出真菌基因組的rRNA基因內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITSs）。將PCR產(chǎn)物純化后測序。

3 結(jié)果

3.1 分離結(jié)果

共從采自浙江地理源的野生鐵皮石斛的根、莖、葉中分離出27株內(nèi)生真菌，其中11株（40.74%）從根中分離出，莖中分離出9株（33.33%），葉中分離出7株（25.93%）。

3.2 內(nèi)生真菌的抑菌活性

平板對峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有7株有抑菌作用（至少對1種對指示菌，抑菌圈直徑大于7 mm），具體見表1。

表1 內(nèi)生真菌的抑菌活性

3.3 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性

上述7株內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物醋酸乙酯萃取相也顯示出了不同程度的抑菌活性。見表2。

表2 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性

3.4 代謝產(chǎn)物醋酸乙酯部分體外抗腫瘤活性

7株菌株代謝產(chǎn)物的醋酸乙酯萃取對HepG2的增殖也產(chǎn)生了不同的抑制作用，見表3。

表3 代謝產(chǎn)物醋酸乙酯部分體外抗腫瘤活性

表4 內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)特征

表5 內(nèi)生真菌所屬菌屬鑒定結(jié)果

3.5 內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)特征和所屬菌屬鑒定結(jié)果

所分離的內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)特征和所屬菌屬鑒定結(jié)果具體見表4和表5。

4 討論

植物的組織基本上都存在內(nèi)生真菌，其種群十分龐大（約有1.5×106種）[8]。植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物不僅豐富且多具有一定的活性：如調(diào)節(jié)植物生長、抑菌、殺蟲、抗腫瘤等[9-10]。葉子等[11]報(bào)道，短葉紅豆杉（Taxusbrevifolia）的韌皮部分離到的內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae可產(chǎn)生與宿主相同的抗腫瘤代謝產(chǎn)物紫杉醇，國內(nèi)外的研究者相繼從植物內(nèi)生真菌中分離到多種可產(chǎn)生抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物，考慮到真菌的來源廣，其生產(chǎn)可通過發(fā)酵、菌種選育或改進(jìn)和控制發(fā)酵工藝等方式來實(shí)現(xiàn)將所需化合物的含量提高的目的，同時(shí)這又不會(huì)將生物資源大量破壞[12]。因此，從真菌中切入，來研究開發(fā)抑菌及抗腫瘤藥物，前景較為廣闊。

鐵皮石斛（dendrobium candidum）屬微子目，蘭科多年生附生草本植物，具有生津、降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用，鑒于鐵皮石斛具有良好的抗腫瘤功效及一定的殺蟲消炎作用，相信它們的內(nèi)生真菌也具有產(chǎn)生與其宿主相同或相似的活性物質(zhì)。另外，內(nèi)生真菌的分布與宿主物種有關(guān)，也與地域有關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在浙江地理源的鐵皮石斛中共分離出27株內(nèi)生真菌，其共歸屬10個(gè)屬。抑菌實(shí)驗(yàn)表明有7株有抑菌作用（至少對1種對指示菌），其代謝產(chǎn)物的醋酸乙酯萃取相也有抑菌和抗腫瘤效果。

綜上所述，鐵皮石斛內(nèi)生真菌具有豐富的種群，將其分離后可發(fā)揮潛在的抑菌和抗腫瘤活性，為抑菌和抗腫瘤候選藥物的開發(fā)提供思路。