劉洋洋,趙 容,梁一凡,殷楚璇

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué),遼寧 大連116600)

r DNA ITS序列是近年來使用的重要分子標(biāo)記技術(shù)之一,主要用于探討植物種內(nèi)變異和種間、近緣屬間分子系統(tǒng)關(guān)系,在不同植物類群中的應(yīng)用價值不同,具有鑒別快速、靈敏、微量、準(zhǔn)確率高等特點,具有非常廣闊的發(fā)展前景。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)[1]序列由于具有在種屬水平的變異度較大、片段較小、易PCR擴(kuò)增、易分析、物種鑒定成功率高等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于植物類藥材的鑒別[2]。本研究將該序列用于細(xì)辛屬植物分子鑒定,同時進(jìn)行了細(xì)辛屬植物物種間的親緣關(guān)系比較研究,為其種類鑒定提供了新的科學(xué)方法,為后續(xù)細(xì)辛藥材的鑒定提供一定的科學(xué)依據(jù)。

r DNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)：rDNA是編碼核糖體DNA的基因,在植物中以重復(fù)連續(xù)排列方式存在,包含進(jìn)化速率不等的編碼區(qū)、非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)和轉(zhuǎn)錄區(qū),可選擇較保守的片段如18S、5S的r DNA進(jìn)行各種親緣關(guān)系的研究。ITS在核糖體DNA中位于18S與26S基因之間。中部被5.8S基因分割為ITS1和ITS2兩個片段。該片段一般適用于研究被子植物屬、種級甚至居群間的系統(tǒng)關(guān)系,在被子植物中ITS的長度為187～298bp,ITS2為187～252bp[3]。

細(xì)辛是一味常用中藥,其中《中華人民共和國藥典》[4](2015年版一部)規(guī)定,細(xì)辛來源為馬兜鈴科植物北細(xì)辛Asarum heterotropoides Fr.Schmidt val.Mandshuricum(Maxim.)Kitag.、漢城細(xì)辛Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai或華細(xì)辛Asar.,具有祛寒解表、散寒止痛、溫肺化軟、宣通鼻竅的功效[5]。味辛,溫,入肺、腎經(jīng)?！侗静菥V目》[6]記載：“細(xì)辛,辛溫能散,故諸風(fēng)濕風(fēng)寒頭痛、痰飲、胸中滯氣、驚癇者,宜用之?？诏?、喉痹、匿齒諸病用之者,取其能散浮熱,亦火郁則發(fā)之之義也?！奔?xì)辛的產(chǎn)地,最早見載于《名醫(yī)別錄》,謂“生華陰”[7]。

本文使用ITS的方法,對不同來源的遼細(xì)辛進(jìn)行種內(nèi)鑒別,以表明ITS序列可以對細(xì)辛原植物進(jìn)行鑒別,且在近緣物種鑒定方面具有較大應(yīng)用價值。ITS序列分析技術(shù)因其準(zhǔn)確、可靠、方便等優(yōu)點備受人們的關(guān)注和推崇[8]。

1 方法與材料

1.1 方法

1.1.1 遼細(xì)辛DNA的提取 選取硅膠干燥的葉片約30 mg,研磨粉碎,使用天根植物基因DNA提取試劑盒(離心柱型)提取總DNA,嚴(yán)格按照試劑盒流程操作。

1.1.2 總DNA PCR的擴(kuò)增 擴(kuò)增引物ITS序列包括正反2個方向,正向引物ITS5F：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAAGG-3'；反向引物ITS4R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR反應(yīng)體系為50μL：含有正反引物各2.0μL(2.5μmol/L),25μL Tap Master Mix,4.0μL總DNA(約40ng),加RNase-Free Water(17μL)補(bǔ)足至50μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸45s(35 cycles),72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后采用雙向測序。

1.1.3 數(shù)據(jù)分析 測序后的序列經(jīng)DNAMAN 8.0軟件拼接、校對,使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行分析比對,計算遺傳距離(K2P)并對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。利用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和BLAST進(jìn)行序列比對,鑒定各樣本[9-10]。

1.2 材料

樣本情況見表1。

表1 樣本來源及ITS序列GenBank登錄號

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列物種鑒定分析

細(xì)辛屬20個樣本ITS序列的PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳總DNA提取成功率100%；ITS序列的細(xì)辛屬20個樣本擴(kuò)增成功率100%；測序成功率100%。對測序所得峰圖分析可知,各序列的堿基質(zhì)量值均大于20。

圖1 樣本基于ITS序列變異位點

2.2 種內(nèi)和種間變異

細(xì)辛屬24個樣本ITS2序列長度為470～490 bp。應(yīng)用MEGA 6.0軟件進(jìn)行序列比對,不同物種間信息位點有645個,堿基變異位點有228個,見圖1。ITS序列種間遺傳變異(0.586～0.616)大于細(xì)辛屬植物的種內(nèi)遺傳變異(0.000～0.020),見圖2。

圖2 樣本基于ITS序列變異的K2P遺傳距離

3 討論

3.1 細(xì)辛植物基原親緣關(guān)系

本實驗NJ樹顯示遼寧省鐵嶺市西豐縣、撫順縣等5個產(chǎn)地同一來源的細(xì)辛在親緣關(guān)系形成穩(wěn)定的分支,支持率達(dá)99%,兩屬4個物種的26個樣本被聚為3大支。細(xì)辛植物自成1支,漢城細(xì)辛屬1支,馬兜鈴屬植物1支。在細(xì)辛植物一支中,遼寧省鐵嶺市西豐縣、撫順縣、新賓縣、清原縣與本溪桓仁縣的ITS序列種內(nèi)變異明顯,分為3小支。從Genbank中下載的馬兜鈴屬2個樣本與細(xì)辛屬容易區(qū)分,單獨聚為1支。而且ITS序列長度與NCBI數(shù)據(jù)庫一致也支持該分支為親緣關(guān)系很近的穩(wěn)定類群,和其他細(xì)辛屬植物有明顯區(qū)別(如圖3)。

圖3 樣本基于ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)聚類樹

3.2 漢城細(xì)辛的分類位置探討

有人認(rèn)為漢城細(xì)辛是華細(xì)辛的變種或變型A.sieboldii var.seoulense、A.sieboldii f.seoulense,從NJ樹及K2P遺傳距離分析,漢城細(xì)辛與北細(xì)辛遺傳距離為(0.586～0.616),達(dá)到種間變異,支持漢城細(xì)辛作為單獨的種,由于漢城細(xì)辛與北細(xì)辛植物形態(tài)差異較小,因此,通過DNA條形碼技術(shù)可以區(qū)分二者。