郭 磊，張紹英，劉家奇，何加鮮，闞 歡，劉 云

（西南林業(yè)大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，云南昆明 650224）

美味牛肝菌（Boletus edulis Bull.Fr.）是世界著名的野生菌，在歐洲被稱為“王者牛肝菌”[1]，是一種在世界范圍內(nèi)分布的食藥兼用、經(jīng)濟價值較高的真菌，我國各省區(qū)均有分布，尤其西南地區(qū)產(chǎn)量較高[2]，且全世界已知的牛肝菌屬已有1 024種，我國已知的可食用的就有199種[3]。云南美味牛肝菌含有豐富的蛋白質(zhì)、粗纖維、多種氨基酸，以及豐富的磷、鉀、鈣、鎂、鐵和鋅等人體必需礦物質(zhì)元素[4]，多種生物堿可治腰腿疼痛、手足麻木、盤骨不舒、四肢抽搐、婦女白帶異常等癥[5]，具有很高的食用價值和藥用價值。

傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)提取方法有堿溶酸沉法、酶法、非蛋白質(zhì)法、復(fù)合法等[6-8]，而堿溶酸沉法具有簡單易行、成本低、提取率高、純度較高等優(yōu)點。超聲波技術(shù)能夠使細胞中的可溶性成分與溶劑分子更好地接觸，從而使可溶性成分更好地釋放出來[9-10]，是近些年發(fā)展的一種高效物理提取技術(shù)，在食品加工業(yè)中應(yīng)用廣泛[11-14]。

目前，美味牛肝菌的研究主要集中加工和活性成分的提取等方面，對美味牛肝菌蛋白質(zhì)的提取及功能性質(zhì)研究方面未見報道。試驗采用超聲波輔助堿法提取云南美味牛肝菌蛋白質(zhì)，初步探討其功能特性，以期為增加美味牛肝菌的附加值、蛋白質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)和開發(fā)利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

云南美味牛肝菌，云南易門縣康源菌業(yè)有限公司提供；標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250，上海勵瑞生物技術(shù)有限公司提供；氫氧化鈉、無水乙醇、磷酸、鹽酸、氯化鈉，以上均為分析純；食用油，市售。

FA1004型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DHG-9240A型鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；JSP-200型多功能粉碎機，浙江永康金穗機械制造廠產(chǎn)品；L550型臺式低速離心機，湖南湘儀試驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；723C型可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；BC/BD-213H型臥式轉(zhuǎn)換型冷凍箱，河南新飛電器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛血清蛋白標(biāo)曲的繪制

參照趙玉紅等人[15]采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)的含量，繪制牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 蛋白質(zhì)得率

美味牛肝菌經(jīng)干燥、粉碎過篩后提取蛋白質(zhì)，離心分離得上清液，采用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)得率計算公式如下：

1.2.3 美味牛肝菌蛋白質(zhì)的提取工藝及優(yōu)化

以蛋白質(zhì)得率為指標(biāo)，研究料液比、提取溫度、超聲波功率、氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度、提取時間等因素對美味牛肝菌蛋白質(zhì)提取效果的影響。蛋白質(zhì)提取的因素設(shè)置為以下水平：固定提取溫度65℃，超聲波功率300W，氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度7 g/L，提取時間1.5 h，考查不同的料液比1∶40，1∶50，1∶60，1∶70，1∶80對蛋白質(zhì)得率的影響；固定料液比1∶60，超聲波功率300 W，氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度7 g/L，提取時間1.5 h，考查不同提取溫度45，55，65，75，85℃對蛋白質(zhì)得率的影響；固定料液比1∶60，提取溫度65℃，氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度7 g/L，提取時間 1.5 h，考查不同超聲波功率250，300，350，400，450 W對蛋白質(zhì)得率的影響；固定料液比1∶60，提取溫度65℃，超聲波功率400 W，提取時間1.5 h，考查不同氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度5，6，7，8，9 mg/mL對蛋白質(zhì)得率的影響；固定料液比1∶60，提取溫度65℃，超聲波功率400 W，氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度7 g/L，考查不同提取時間0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h對蛋白質(zhì)得率的影響。

在單因素的基礎(chǔ)上，選擇對美味牛肝菌蛋白質(zhì)得率影響較大的料液比、提取溫度、超聲波功率、提取時間為考查因素，采用四因素三水平正交試驗進行優(yōu)化獲得云南美味牛肝菌蛋白質(zhì)的最佳提取工藝條件。

因素與水平設(shè)計見表1。

表1 因素與水平設(shè)計

1.2.4 美味牛肝菌蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)

（1）美味牛肝菌蛋白質(zhì)的制備。利用蛋白質(zhì)在pH值=pI時發(fā)生蛋白質(zhì)析出的方法得到蛋白質(zhì)沉淀。按照最佳條件將蛋白質(zhì)提取液的pH值準(zhǔn)確調(diào)至4.5并靜置2 h后，再經(jīng)高速離心機以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心30 min，干燥后用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量為65.7%。

（2）溶解性。①溫度對蛋白質(zhì)溶解性的影響。參考張燕鵬等人[16]的方法并略作調(diào)整，將1%的蛋白質(zhì)溶液分別在30，40，50，60，70，80，90℃下水浴加熱1 h后快速冷卻至室溫，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心30 min，取上清液用紫外可見分光光度計于波長595 nm處測定吸光度。②pH值對蛋白質(zhì)溶解性的影響。參考張燕鵬等人[16]的方法并略作調(diào)整，用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)1%的蛋白質(zhì)溶液，使其pH值分別為2，3，4，5，6，7，8，9，于室溫下攪拌1 h后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心30 min，取其上清液于波長595 nm處測定吸光度。③離子強度對蛋白質(zhì)溶解性的影響。參考張燕鵬等人[16]方法并略作調(diào)整，將1%蛋白質(zhì)溶液各1 mL置于質(zhì)量分數(shù)分別為1%，2%，3%，4%，5%的NaCl溶液中，然后調(diào)節(jié)pH值梯度依次為2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，于室溫下攪拌1 h后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心30 min，取其上清液于波長595 nm處測定吸光度，同時以不加蛋白質(zhì)的溶液為空白。

（3）持水性。參照Lqari H等人[17]方法并略作調(diào)整，稱取1 g美味牛肝菌蛋白質(zhì)置于離心管中與去離子水混合均勻，靜置10 min后以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min，除上層液體后稱質(zhì)量，按公式（2）計算持水性（WHO），以大豆分離蛋白為對照。

式中：W1——分離蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；

W2——離心管質(zhì)量，g；

W3——離心管和持水后樣品質(zhì)量，g。（4）起泡性及泡沫穩(wěn)定性。參照Lawhon J等人[18]方法并略作調(diào)整，取1%蛋白質(zhì)溶液50 mL以轉(zhuǎn)速8 000 r/min攪拌1 min后測定泡沫體積V0。靜置120 min后測量泡沫的體積V120，經(jīng)公式（3）、（4）計算起泡能力（FC）和泡沫穩(wěn)定性（FS），以大豆分離蛋白為對照。

（5）持油性。參照Fuhrmeister H等人方法并略作調(diào)整，取1 g蛋白質(zhì)與10 mL大豆油放入離心管中并振蕩混勻后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心20 min除去游離的油脂，再次稱質(zhì)量，按公式（5）計算持油性（FBC），以大豆分離蛋白為對照。

式中：W1——離心管和蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；

W2——蛋白質(zhì)、油脂和離心管質(zhì)量，g；

W0——蛋白質(zhì)質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛血清蛋白標(biāo)曲的繪制

于波長595 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程Y=0.752 9X+0.005 9，R2=0.997 4，線性范圍在0~0.1 mg/mL。

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對蛋白質(zhì)得率的影響

料液比對蛋白質(zhì)得率的影響見圖2。

由圖2可知，美味牛肝菌蛋白質(zhì)的得率隨著料液比的升高呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢。在料液比為1∶60（g∶mL）時，得率達到最大，為15.390%。這是由于隨著料液比的增大，體系的黏度降低，傳質(zhì)過程加快，因而得率提高，綜合考慮最適料液比為 1∶60。

圖2 料液比對蛋白質(zhì)得率的影響

2.2.2 提取溫度對蛋白質(zhì)得率的影響

提取溫度對蛋白質(zhì)得率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對蛋白質(zhì)得率的影響

由圖3可知，美味牛肝菌蛋白質(zhì)得率隨提取溫度的升高呈先增后減的趨勢，并在提取溫度為65℃時達到最大，為15.326%。這是因為前期溫度的升高有利于蛋白質(zhì)的溶解，同時超聲波的作用加速了蛋白質(zhì)的溶出；但提取溫度過高，提取出來的蛋白質(zhì)變性析出會導(dǎo)致上清液中蛋白質(zhì)含量降低，得率減小。因此，最適提取溫度均為65℃。

2.2.3 超聲波功率對蛋白質(zhì)得率的影響

超聲波功率對蛋白質(zhì)得率的影響見圖4。

圖4 超聲波功率對蛋白質(zhì)得率的影響

由圖4可知，美味牛肝菌蛋白質(zhì)得率隨超聲波功率的增大呈先增后減的趨勢，并在超聲波功率為400 W時達到最大，為16.028%。這是由于超聲波功率的增大，超聲波對細胞的破碎作用也越強，云南美味牛肝菌中蛋白質(zhì)溶出也越多而使得率不斷增大；但超聲波功率過大時部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性，導(dǎo)致得率降低。因此，最適超聲波功率為400 W。

2.2.4 氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度對蛋白質(zhì)得率的影響

圖5 氫氧化鈉質(zhì)量濃度對蛋白質(zhì)得率的影響

氫氧化鈉質(zhì)量濃度對蛋白質(zhì)得率的影響見圖5。由圖5可知，美味牛肝菌蛋白質(zhì)的得率隨著氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度的升高呈現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢，并在氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度7 g/L時達到最大，為16.515%。這是因為蛋白在堿性條件下溶解度較大，所以堿液濃度越高蛋白質(zhì)得率越高；但當(dāng)堿液濃度過高，蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)解體而引起變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)得率降低，因此最適氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度為7 g/L。

2.2.5 提取時間對蛋白質(zhì)得率的影響

提取時間對蛋白質(zhì)得率的影響見圖6。

圖6 提取時間對蛋白質(zhì)得率的影響

由圖6可知，美味牛肝菌蛋白質(zhì)得率隨提取時間的延長呈先增后減的趨勢，提取時間2 h時得率最高，為16.956%。提取時間過長，蛋白質(zhì)會凝聚沉淀，導(dǎo)致蛋白質(zhì)得率降低。因此，最適提取時間為2 h。

2.3 正交試驗

基于單因素的試驗結(jié)果，建立L9（34）正交試驗。

正交試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

由表2可知，影響美味牛肝菌蛋白質(zhì)得率的因素由大到小依次為B（提取溫度）>A（料液比）>C（氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度）>D（提取時間），超聲波輔助堿法提取美味牛肝菌蛋白質(zhì)的最佳條件為A2B3C3D2，即料液比1∶60（g∶mL），提取溫度75℃，超聲波功率450 W，氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度7 g/L，提取時間2 h，在此工藝條件下進行驗證，蛋白質(zhì)得率為17.001%。

2.4 美味牛肝菌蛋白質(zhì)的溶解性

2.4.1 提取溫度對蛋白質(zhì)溶解性的影響

提取溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響見圖7。

圖7 提取溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響

由圖7可知，當(dāng)提取溫度為70℃時美味牛肝菌蛋白質(zhì)的溶解度最??；提取溫度在30~60℃時升溫有助于蛋白質(zhì)的溶解；在60~70℃時，隨著提取溫度的升高，美味牛肝菌蛋白質(zhì)發(fā)生變性，導(dǎo)致溶解度降低；當(dāng)溫度超70℃時，可能因為部分蛋白質(zhì)分子的聚集體轉(zhuǎn)化為可溶性聚集體，而造成蛋白質(zhì)溶解度增大，這說明高溫處理可以改善美味牛肝菌蛋白質(zhì)的溶解性。

2.4.2 pH值對蛋白質(zhì)溶解性的影響

pH值對蛋白質(zhì)溶解性的影響見圖8。

圖8 pH值對蛋白質(zhì)溶解性的影響

由圖8可知，當(dāng)pH值4.0時接近等電點，故美味牛肝菌蛋白質(zhì)的溶解度較小，當(dāng)pH值不斷增大，美味牛肝菌的溶解度也隨之增大。pH值對蛋白質(zhì)的解離性和帶電性影響很大，改變了蛋白質(zhì)同水的結(jié)合能力，從而影響其溶解性。

2.4.3 離子強度對蛋白質(zhì)溶解性的影響

氫化鈉溶液質(zhì)量分數(shù)對蛋白質(zhì)溶解性的影響見圖9。

圖9 氫化鈉溶液質(zhì)量分數(shù)對蛋白質(zhì)溶解性的影響

由圖9可知，pH值為2和4時美味牛肝菌蛋白質(zhì)的溶解性變化隨氯化鈉溶液質(zhì)量分數(shù)增加表現(xiàn)不明顯，溶解性差于其他pH值條件；在pH值6時的溶解性隨氯化鈉溶液質(zhì)量分數(shù)的增加略有提升，可能由于蛋白質(zhì)表面的電荷增加利于蛋白質(zhì)溶解，而后繼續(xù)增大氯化鈉溶液質(zhì)量分數(shù)時發(fā)生鹽析而導(dǎo)致溶解度下降；在pH值為8和10時的堿性條件下蛋白質(zhì)帶較多靜電荷，但鹽溶液的正負離子屏蔽了靜電荷，同時氯化鈉與蛋白質(zhì)爭奪水分子的能力增強，使蛋白質(zhì)溶解性降低。

2.5 美味牛肝菌蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)分析

美味牛肝菌蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)分析見表3。

表3 美味牛肝菌蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)分析 /%

由表3可知，美味牛肝菌蛋白質(zhì)與香椿籽蛋白質(zhì)、菜籽蛋白質(zhì)、大豆分離蛋白質(zhì)和美藤果蛋白質(zhì)相比，在起泡性方面具有較顯著的優(yōu)勢，持水性和泡沫穩(wěn)定性略高于香椿籽蛋白質(zhì)，但持水性和持油性明顯低于其他幾種蛋白質(zhì)。功能性質(zhì)方面的差異主要與蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、濃度、分子間相互作用等因素有關(guān)，美味牛肝菌蛋白質(zhì)分子能快速地擴散到氣-液界面并通過分子間作用形成黏彈性的吸附膜。

3 結(jié)論

影響美味牛肝菌蛋白質(zhì)的超聲提取因素主要有料液比、提取時間、氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度和提取溫度，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上采用正交試驗優(yōu)化得出美味牛肝菌蛋白質(zhì)的最佳超聲波提取條件，即料液比1∶60（g∶mL），提取溫度75℃，超聲波功率450 W，氫氧化鈉溶液質(zhì)量濃度7 g/L，提取時間2 h，此條件下蛋白質(zhì)得率為17.001%。

提取溫度、pH值和離子濃度對美味牛肝菌蛋白質(zhì)溶解性的影響不同，較高提取溫度和pH值、較低離子濃度對美味牛肝菌蛋白質(zhì)的溶解特性是有利的。美味牛肝菌蛋白質(zhì)在起泡性方面優(yōu)于香椿籽蛋白質(zhì)、菜籽蛋白質(zhì)、大豆分離蛋白質(zhì)和美藤果蛋白質(zhì)，持水性和泡沫穩(wěn)定性略高于香椿籽蛋白質(zhì)，但持水性和持油性明顯低于其他幾種蛋白質(zhì)。