劉勝男，孟繼秋，曹金博，李燕虹，王 耀，衛(wèi) 星

（1.三門峽出入境檢驗檢疫局，河南三門峽 472000；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，食品加工與安全國家級實驗教學(xué)示范中心，河南洛陽 471023；3.三門峽市檢驗檢疫中心，河南三門峽 472000）

花生具有很高的營養(yǎng)價值，富含不飽和脂肪酸及優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，可促進人體的生長發(fā)育、抗老化，對胃腸功能起到保護的作用[1]。但是花生也是一種重要的致敏食物，有關(guān)學(xué)者統(tǒng)計，食品過敏的發(fā)病率很高，達到了2%，在成年人中更是高達4%~8%[2-4]。1995年，聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO） 認(rèn)定的8種最常見的致敏食物中，花生就包括在內(nèi)。因此，為了保障消費者的安全，大部分發(fā)達國家的食品包裝標(biāo)簽中強制要求標(biāo)識過敏原成分[5]。然而，當(dāng)今國際上并未給出明確統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，對包裝食品中過敏原進行標(biāo)識和限量[6-9]。而且到目前為止，針對花生過敏癥狀沒有快速有效的治療方法。因此，避免食用含有花生致敏蛋白的食物是對花生過敏人群最好的保護。為了更好地保障廣大消費者的食品安全，對花生致敏蛋白的檢測研究和探索也就變得非常有意義。

1 花生致敏蛋白概述

花生中能引起人體發(fā)生過敏反應(yīng)的物質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以稱為致敏蛋白，其致敏原理就是通過有選擇性的激活機體的免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫球蛋白，引起I型超敏反應(yīng)。目前，已被認(rèn)可的花生致敏蛋白有13種（Ara h1到Ara h13），其中Ara h1，Ara h2和Ara h3能被大部分的過敏患者血清識別，是重要的致敏蛋白，也是檢測研究的重點對象。

花生過敏原的種類及其特征見表1。

1.1 花生中的主要致敏蛋白

1.1.1 Ara h1

Ara h1占花生蛋白總量的12%~16%，是含量最多的致敏蛋白。其單體是分子量約為64 kD的糖蛋白[10]；Ara h1的三聚體形式?jīng)Q定了其穩(wěn)定性極高的特性，胃腸道的消化作用和加熱都不會破壞其致敏性，不容易破壞，過敏反應(yīng)非常強[11]。

表1 花生過敏原的種類及其特征

1.1.2 Ara h2

Ara h2占花生蛋白總量的5.9%~9.3%[12]；Ara h2包含Ara h2.01和Ara h2.02這2種遺傳變異體[13]，分子量范圍在17~20 kD。Ara h2.02比Ara h2.01缺失了12個氨基酸[14]。由于Ara h2中二硫鍵較多，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并且耐酶解。通過破壞其二硫鍵可降低其穩(wěn)定性[15-16]。Ara h2易與 Ara h1，Ara h3引起交叉反應(yīng)[17]。Ara h2可作為胰蛋白酶抑制劑，因為它們在結(jié)構(gòu)上有很高的相似度，并且加熱會使Ara h2蛋白的抑制劑活性顯著提高[18]。

1.1.3 Ara h3

Ara h3具有低聚態(tài)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[19]，屬于雙Cupin類型[20]。Ara h3.01和Ara h3.02是其2個遺傳變異體。Ara h3存在4個與IgE結(jié)合的表位[21]。大部分花生過敏患者的血清都能識別Ara h1和Ara h2，而只有半數(shù)的亞洲患者和歐美患者的血清可以識別Ara h3，研究人員認(rèn)為Ara h3蛋白不容易被識別的原因可能是抗原表位序列被深埋在高級結(jié)構(gòu)內(nèi)部，也可能與IgE抗原結(jié)合位點的不保守序列有關(guān)[22]。Ara h3免疫結(jié)合位點四級結(jié)構(gòu)比較完整，不易被蛋白酶徹底水解。Ara h3最高能耐受70~92℃的溫度，但前提是在適宜的離子強度下[23]。Ara h3在被水解為酸性堿性片段后，仍可導(dǎo)致機體發(fā)生過敏反應(yīng)[24]。

1.2 其他致敏蛋白

Ara h1~Ara h3這3種致敏蛋白可被大部分過敏患者血清識別，相關(guān)研究相對較多。Ara h4~Ara h13只能被少數(shù)過敏患者的血清識別，相關(guān)的研究相對較少，下文主要介紹Ara h4~Ara h13目前已知的一些基本信息。

Ara h4不再被認(rèn)為是一個獨特的致敏蛋白，其本質(zhì)就是Ara h3.02[25]。Ara h5是一種肌動蛋白，幾乎存在于所有真核細(xì)胞。Ara h6和Ara h7在花生中含量很低，Ara h6與Ara h2有59%的同源性，而且熱穩(wěn)定性好，耐酶解[26]；Ara h7與Ara h2有35%的同源性。Mittag D等人[27]認(rèn)為花生蛋白Ara h8是一種非常重要的致敏蛋白，它不光可以引起花生過敏，還會使樺樹花粉過敏患者過敏，但是Ara h8熱穩(wěn)定性差，不耐酶解[28]。Ara h9是一種非特異性的脂轉(zhuǎn)運蛋白，具有耐酶解、耐高溫的特性[29]。Ara h10，Ara h11是從花生油脂中提取出來的，屬于油脂蛋白。Rabjohn P等人[30]首次開發(fā)了一種新型的花生3種油脂蛋白（14，16，18 kD） 表達和純化系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)重組表達的油脂蛋白與天然的油脂蛋白非常類似。Ara h12的分子量有8，12，5.184 kD 3種，Ara h13同樣有8，11，5.472 kD 3種，都屬于防衛(wèi)素。

2 主要致敏蛋白的檢測方法

目前，檢測花生致敏蛋白的方法分為2個方面：一是基于致敏蛋白的檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫印跡（IB）、高效液相色譜技術(shù)（HPLC） 及質(zhì)譜分析技術(shù)（MS）；二是基于致敏蛋白成分基因的檢測方法，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）[31]。

2.1 基于致敏蛋白的檢測方法

2.1.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是利用抗原抗體的特異性反應(yīng)來檢測被測物質(zhì)，具有檢測靈敏度高、特異性強、時間短的特點。ELISA法有夾心法、間接法和競爭法，其中雙抗夾心ELISA法和競爭ELISA法適合花生致敏蛋白的檢測。閆飛等人[32]使用ELISA方法檢測了花生致敏蛋白Ara h6，IC50為414.6 ng/mL，在16.5~10 000 ng/mL的范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，并且精確度和重復(fù)性很好。但是加熱過程會改變致敏蛋白的一級結(jié)構(gòu)，使抗體無法正確識別被檢測過敏原，產(chǎn)生假陰性現(xiàn)象[33]。除此之外，ELISA這種抗原抗體的檢測模式也會出現(xiàn)交叉反應(yīng)，會出現(xiàn)檢測值偏高和假陽性現(xiàn)象，影響試驗結(jié)果準(zhǔn)確性。

2.1.2 免疫印跡

免疫印跡（Immunoblotting，IB）又稱蛋白印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)中分析蛋白質(zhì)的常用技術(shù)，類似于ELISA，都屬于免疫標(biāo)記技術(shù)，具有操作簡單、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點。其原理是利用SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白質(zhì)按分子量大小分離，再將分離好的蛋白質(zhì)固定在固相載體上，然后以抗體作為“探針”去檢測蛋白質(zhì)，用標(biāo)記的二抗“顯色”。

Burks[34]運用免疫印跡的方法，通過對過敏患者的血樣進行檢測。結(jié)果表明，致敏蛋白為一種分子量為17 kD，等電點為5.2的蛋白質(zhì)。根據(jù)試驗數(shù)據(jù)和其氨基酸順序最終斷定此種致敏蛋白是Ara h2。目前，這種方法已經(jīng)很成熟，許多公司設(shè)計出特異性抗體用于檢測蛋白質(zhì)，但是試劑盒的價格比較昂貴，可以通過回收未參與反應(yīng)的抗體并重復(fù)利用，可以在一定程度上降低檢測成本。

雖然免疫印跡的方法在檢測花生致敏蛋白試驗中有很多優(yōu)勢，但是因為試驗操作的原因容易出現(xiàn)多條帶、沒有條帶、背景有黑色斑點、凝膠染色不均勻等現(xiàn)象，影響試驗的準(zhǔn)確性，所以免疫印跡大多用于致敏蛋白的定性分析。

2.1.3 高效液相色譜與質(zhì)譜分析

高效液相色譜技術(shù)（High pressure liquid chromatography，HPLC）是在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，加入氣相色譜理論與技術(shù)而發(fā)展起來的一項新技術(shù)。質(zhì)譜檢測花生致敏蛋白主要是根據(jù)不同致敏蛋白分子在均勻電場中停留時間不同，進而達到分離鑒定的目的。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）是將復(fù)雜樣品經(jīng)過液相色譜分離后，再用質(zhì)譜儀進行檢測定性的技術(shù)。將二者的分離功能和定性功能結(jié)合起來，對于復(fù)雜的混合物也可以很好地進行定性和定量。并且樣品的前處理過程簡化了，能夠快速檢測樣品，操作也比較簡單。洪宇偉等人[35]運用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測花生中Ara h2致敏蛋白，其檢測限可達6.23 μg/g，回收率達到107.0%~113.2%。

此方法可對花生致敏蛋白實現(xiàn)快速定性、定量分析，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是由于對樣品和操作的要求比較高，儀器比較昂貴，使得其應(yīng)用受到限制。

2.1.4 表面等離子共振

表面等離子共振（Surface plasmon resonance，SPR）是一種物理光學(xué)現(xiàn)象，是根據(jù)金屬納米粒子表面附著不同物質(zhì)導(dǎo)致折射率發(fā)生變化，其折射率的變化和待分析物質(zhì)量呈一定線性關(guān)系，利用此原理可實現(xiàn)對待分析物質(zhì)準(zhǔn)確的定性、定量分析。與其他檢測方法相比，SPR具有體積更小、成本更加低廉、響應(yīng)速度較快和抗干擾能力強等優(yōu)點，可以實現(xiàn)對樣品的實時在線檢測[36]。Pollet J等人[37]結(jié)合SPR法與納米磁珠抗體提取技術(shù)，快速準(zhǔn)確檢測巧克力中花生過敏原Ara h1，其檢測限為0.09 μg/mL。由于SPR也采用免疫學(xué)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，所以也會出現(xiàn)假陽性、假陰性等影響試驗準(zhǔn)確性的結(jié)果。

2.2 基于致敏原成分基因的檢測方法

2.2.1 聚合酶鏈反應(yīng)

一些花生致敏蛋白雖然由于結(jié)構(gòu)的原因，可以在高溫環(huán)境下保持活性，但是在花生實際的加工生產(chǎn)過程中會經(jīng)過一系列復(fù)雜的加工方式，可能會使花生致敏蛋白的結(jié)構(gòu)受到破壞，免疫活性降低，此時再用抗原抗體特異性結(jié)合的傳統(tǒng)方法將會使試驗結(jié)果出現(xiàn)偏差，但普通的加工處理不能破壞花生致敏蛋白的DNA，因此可以通過PCR法來檢測花生致敏蛋白的基因。應(yīng)用PCR技術(shù)擴增食品中花生源性物質(zhì)的DNA片段，通過凝膠電泳得到DNA圖譜，最后通過對比來判斷擴增結(jié)果。經(jīng)過多年的研究發(fā)展，傳統(tǒng)PCR技術(shù)已經(jīng)很成熟，近年來新研發(fā)的Real-time PCR更加方便快捷，在檢測花生致敏蛋白方面有著廣泛的應(yīng)用，且靈敏度高、特異性強等[38]。

Houhoula D等人[39]采集了152份樣品，采用實時PCR方法進行分析。結(jié)果表明，花生樣品中有125份（83%）呈陽性。因此，實時PCR技術(shù)是快速檢測和定量食品致敏蛋白的重要手段。另外，也有研究人員采用復(fù)合引物技術(shù)設(shè)計了一個競爭性內(nèi)擴增控制，建立了花生致敏蛋白Ara h1 DNA的實時PCR檢測方法，其檢出限為0.005%，表明該方法對食品中花生成分的檢測具有較高的靈敏度。

目前使用PCR檢測花生過敏原由于容易出現(xiàn)假陰性和假陽性的現(xiàn)象，對于PCR技術(shù)在檢測花生致敏蛋白的推廣還具有一定的局限性。

2.2.2 實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)

實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)就是在原本的PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，其中Taqman探針法和SYBR Green I熒光染料法是常用的熒光標(biāo)記方法。此方法通過熒光信號量的積累來實現(xiàn)監(jiān)測PCR進程，以達到檢測花生致敏蛋白特異性基因的目的。陳家杰等人[40]利用SYBR Green I實時熒光PCR法檢測花生致敏蛋白。對8種花生食品進行檢測，結(jié)果8種食品中的成分均與標(biāo)簽相符，證明此方法可用于食品中花生致敏蛋白的檢測。

基于基因方面的檢測具有極高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但是，一些試驗證明某些加工處理可除去花生中的部分致敏蛋白，但殘留的致敏基因仍能使試驗結(jié)果呈陽性，出現(xiàn)錯誤的檢測結(jié)果，這是基因檢測手段存在的弊端。

3 結(jié)語

食品導(dǎo)致過敏的事件越來越多，并且復(fù)雜的加工生產(chǎn)方式使得致敏物質(zhì)更加難以檢測。因此，建立食品中花生致敏蛋白檢測技術(shù)，對保障花生過敏人群生命安全具有重要性。介紹了花生中的主要致敏蛋白和常見的檢測方法，但這些方法或多或少都存在一些不足之處。近年來，上轉(zhuǎn)換材料、熒光量子點、碳點等新型標(biāo)記材料的廣泛使用給花生致敏蛋白檢測方法研究提供了新的研究方向。這些新型材料與目前檢測技術(shù)相結(jié)合，能夠在一定程度上提高檢測方法的靈敏度和特異性，為食品中花生過敏原的檢測提供廣闊的發(fā)展前景。