敖紹林，宋成建，周賢平，裴正飛，高 陽(yáng)，周福才，張亞州*

(1.貴州理工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550031；2.廣西苷亮健生物技術(shù)有限公司，廣西 南寧 530001)

0 引言

木姜葉柯為殼斗科柯屬植物L(fēng)ithocarpus litseifolius(Hance)Chun.屬常綠喬木，別名甜茶(通稱)、甜葉子樹(shù)(云南)、胖稠(廣東)、甜味菜、大葉稠子、甘茶(貴州)、多穗石柯等，其以野生狀態(tài)分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南各省區(qū)海拔500～2 500 m的低山密林中，印度、泰國(guó)也有分布[1]?，F(xiàn)代研究表明，木姜葉柯中的黃酮類成分主要是根皮苷與三葉苷，屬于二氫查爾酮類，它們具有降血糖，降血壓，降脂及抗過(guò)敏，抗炎等作用，尤其根皮苷在糖尿病及其并發(fā)癥的防治中具有獨(dú)特的效果[2-5]。但是木姜葉柯中另外一類主要化學(xué)成分為多酚類，具有抗氧化和清除自由基功能活性物質(zhì)，還有抗腫瘤、抑菌、抗病毒、抗心腦血管疾病等活性，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和保健行業(yè)，具有極大的利用前景[6]。

木姜葉柯甜茶在2017年6月獲得了國(guó)家衛(wèi)計(jì)委新食品原料批復(fù)，在民間多使用其娕葉經(jīng)加工而成的代茶飲。本研究擬通過(guò)對(duì)收集的主要產(chǎn)區(qū)的木姜葉柯的各種茶葉及原植物共12份樣品，采用Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定樣品中的總酚含量，以明確不同產(chǎn)地、不同來(lái)源的木姜葉柯茶葉及原植物中多酚情況的了解。

1 試劑、試藥與儀器

木姜葉柯樣品為廣西苷亮健生物技術(shù)公司供應(yīng)或通過(guò)購(gòu)買獲得(詳細(xì)情況見(jiàn)下表1中內(nèi)容)，所有樣品均由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院董立莎教授鑒定為木姜葉柯植物來(lái)源；沒(méi)食子酸對(duì)照品(購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所)，無(wú)水碳酸鈉(分析純，秦皇島市化學(xué)試劑廠)，鎢酸鈉(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，鉬酸鈉(分析純，天津市化學(xué)試劑四廠)，硫酸鋰(分析純，重慶東方試劑廠)；乙腈(HPLC級(jí)，成都科龍?jiān)噭┯邢薰?；甲醇(HPLC級(jí)，成都科龍?jiān)噭┯邢薰?；磷酸(分析純，北京化工廠)；水為娃哈哈純凈水。TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度儀(北京普析通用儀器有限公司)；BSA124S分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山 市超聲儀器有限公司)。

表1 收集的木姜葉柯原植物部位及茶的樣品

2 方法與結(jié)果[7-8]

2.1 磷鉬鎢酸試液的配制

取鎢酸鈉100 g，鉬酸鈉25 g，加水700 mL使溶解，加鹽酸 100 mL、磷酸 50 mL，加熱回流10 hr，放冷后現(xiàn)加硫酸鋰 150 g，水50 mL和溴0.2 mL，煮沸除去殘留的溴(約15 min)，冷卻，加水稀釋至1 000 mL，濾過(guò)，即得。

2.2 對(duì)照溶液的配制

精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品25.2 mg，置25 mL的棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置100 mL的棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得(每mL中含沒(méi)食子酸0.0504 mg)

2.3 供試品溶液的配制

精密稱取樣品約100 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水適量，放置 30 min，振搖，超聲處理30 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 總酚測(cè)定

精密量取供試品溶液1 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液 1 mL，再分別加水11 mL，用29%的碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30分鐘(以相應(yīng)的試劑為空白)，照紫外—可見(jiàn)分光光度法在760 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液 0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置 25 mL 的棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1 mL，再分別加水 11.5 mL、11 mL、10 mL、9.0 mL、8 mL、7 mL，用29%的碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30分鐘(以相應(yīng)的試劑為空白)，照紫外—可見(jiàn)分光光度法在760 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別以在760 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定的吸收值A(chǔ)，以溶液濃度C(μg)對(duì)吸收值A(chǔ)進(jìn)行線形回歸，得線形回歸方程：C=270.877 A-8.307；r=0.9995；線形范圍：25.2～201.6 μg 時(shí)線性關(guān)系良好。見(jiàn)下表2：

表2 沒(méi)食子酸線性關(guān)系考察(n=3)

2.5.2 精密度試驗(yàn)

取溶液，精密吸取上配同一對(duì)照品溶液(濃度50.4 μg·mL-1)2 mL，置 25 mL 棕色量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項(xiàng)下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1 mL”起，加水9 mL，重復(fù)6次測(cè)定吸光度(以相應(yīng)的試劑操作為空白)，即得。結(jié)果吸光度值RSD為0.15%，精密度良好。見(jiàn)下表3：

表3 精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)(n=6)

2.6 重復(fù)性研究

精密稱取樣品11粉末約100 mg，平行3份，加水適量，放置30 min，振搖，超聲處理30分鐘，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。依法測(cè)定吸光度A，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒(méi)食子酸的量(mg)，即得。結(jié)果總多酚含量測(cè)定方法重復(fù)性試驗(yàn)表明RSD為0.56%，(n=3)，樣品重復(fù)性良好。見(jiàn)下表4：

表4 總多酚含量測(cè)定的重復(fù)性試驗(yàn)(n=3)

2.7 穩(wěn)定性研究

精密吸取同一重復(fù)性試驗(yàn)的供試品(樣品11)溶液，分別在不同時(shí)間(0，1，2，4 hr)測(cè)定，結(jié)果表明，樣品總生物堿測(cè)定在2小時(shí)基本保持穩(wěn)定，所以樣品配制后最好在2 hr內(nèi)測(cè)定結(jié)果較好。見(jiàn)下表5：

表5 總多酚含量測(cè)定的穩(wěn)定性試驗(yàn)(n=3)

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱取上面重復(fù)性試驗(yàn)樣品11(樣品中總多酚含量9.095%)9份各50 mg，精密加入其樣品總多酚含量的75%、100%、125%的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液(精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照50.2 mg至50 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。濃度 1.004 mg·mL-1)加水適量，放置30 min，振搖，超聲處理30 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。測(cè)定吸光度A，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒(méi)食子酸的量(mg)，即得。結(jié)果表明，本總多酚含量測(cè)定方法的加樣平均回收率102.23%，RSD為0.77%，回收率良好。

表6 總多酚加樣回收率考察試驗(yàn)數(shù)據(jù)(n=9)

2.9 樣品中多酚含量測(cè)定結(jié)果

方法同上，樣品測(cè)定中處理方法，測(cè)定吸光度A，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒(méi)食子酸的量(mg)，即得。結(jié)果見(jiàn)表11。

表7 藥材樣品中總多酚含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

結(jié)果如表7所示，通過(guò)本試驗(yàn)方法測(cè)定發(fā)現(xiàn)收集的嫩葉中總酚含量最高，多酚含量為11.414%；其次為其它以嫩葉為原料加工的代茶制品，含量最低的為枝條，多酚含量為1.806%。

3 結(jié)語(yǔ)

目前對(duì)木姜葉柯葉中主要成份的研究主要集中根皮苷、三葉苷和根皮素等二氫查爾酮類成分，由于它們的含量較高，一般認(rèn)為它們?yōu)橹饕π镔|(zhì)。多酚類成分在木姜葉柯植物及茶葉加工品中往往被忽略，另外由于多酚類成分化學(xué)成分較復(fù)雜，也導(dǎo)致了對(duì)它們的相關(guān)研究較少。

本研究中選用的Folin-Ciocalteu比色法進(jìn)行總酚測(cè)定時(shí)，放置時(shí)間不能太長(zhǎng)，進(jìn)行顯色后應(yīng)盡量在2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行樣品的測(cè)定；對(duì)樣品的處理溶劑中發(fā)現(xiàn)，甲醇、乙醇容易使總酚成分含量偏低而影響含量的測(cè)定結(jié)果，所以最后確定提取溶劑選用水較合適。

本次研究就主要針對(duì)對(duì)收集于不同產(chǎn)地，不同部位的原植物及加工制品進(jìn)行其總酚含量測(cè)定?？偡訙y(cè)定本實(shí)驗(yàn)采用了傳統(tǒng)的Folin-Ciocalteu比色法，最后確定收集到的12份木姜葉柯樣品中總酚的含量差異較大，范圍從1.806%到11.414%之間，而其中木姜葉柯枝干樣品中總酚遠(yuǎn)遠(yuǎn)的低于廣西南陽(yáng)鄉(xiāng)木姜葉柯嫩葉樣品中含量，老葉中的總酚含量也低于一般其它的以嫩葉為原料的制成品。