李春冬，徐偉良，魯 鐵，郭 梁，3*

（1.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院 生物工程研究院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000；2.河南城建學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，河南 平頂山 467000；3.錫林郭勒職業(yè)學(xué)院 食品檢驗檢測和風(fēng)險評估中心，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000）

纖維素酶是一類將木質(zhì)纖維素水解的糖基水解酶，普遍存在于天然的生物體內(nèi)，是我國第四大工業(yè)酶[1]，其主要應(yīng)用于環(huán)境保護、食品加工和可持續(xù)利用能源等與人類生活相關(guān)的行業(yè)中[2-5]。目前，用于生產(chǎn)纖維素酶的真菌大多數(shù)屬于木霉屬（Trichderma）、青霉屬（Penicillum）、曲霉屬（Aspergillus）、根霉屬（Rhizopus）等[6]。木霉所產(chǎn)的纖維素酶多數(shù)是胞外酶，產(chǎn)率高，且容易分離和提取，同時還產(chǎn)漆酶、木聚糖酶、植酸酶等多種酶類[7]，因此，木霉被公認是產(chǎn)纖維素酶較高的菌種之一。目前，國內(nèi)外學(xué)者對纖維素酶的研究報道很多[8-9]，SOUZA M F D等[10]從巴西亞馬遜森林中篩選獲得一株纖維素酶活性為1.63 FPU/mL的木霉菌；JAIN A等[11]研究發(fā)現(xiàn)，一株深綠木霉（Trichoderma atroviride）的最大濾紙酶活（filter paper activity，F(xiàn)PA）、羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulase，CMCase）和木聚糖酶活分別為0.25 FPU/mL、0.18 IU/mL、5.8 IU/mL。

白樺（Betula platyphyllaSuk.）是我國東北、華北、西北、西南地區(qū)森林植被的主要組成樹種，常形成單獨純木林或與其他針闊葉樹種組成混交林，是森林生態(tài)系統(tǒng)演替中著名的先鋒樹種[12]。錫林郭勒盟地區(qū)白樺樹種資源豐富，是該地區(qū)的主要樹種之一，具有豐富的纖維素資源，因此，錫林郭勒盟地區(qū)白燁可作為產(chǎn)纖維素酶木霉篩選的重要材料。為提高本地區(qū)木材廢棄物的利用率，前期已采用樺木木屑為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，以纖維素酶活力為評價指標，對錫林郭勒野生木霉菌株進行分離培養(yǎng)，篩選出一株具有產(chǎn)纖維素酶潛力的木霉菌株XLGL201709100。

本研究以前期篩選的一株木霉XLGL201709100為研究對象，采用分子生物學(xué)技術(shù)對其進行鑒定，并對其最適生長固體培養(yǎng)基進行篩選，為后續(xù)木霉菌種保藏研究提供實驗基礎(chǔ)。同時，利用濾紙酶活（filter paper activity，F(xiàn)PA）法評價該木霉產(chǎn)纖維素酶的能力，以期為更好的利用本地區(qū)木材廢棄物資源提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

木霉XLGL201709100：分離自錫林郭勒盟野生白樺林。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[13-14]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L。

改良麥粒汁瓊脂培養(yǎng)基[15]：麥粒汁100 g，葡萄糖15 g，蛋白胨5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。

木生菌葡萄糖蛋白胨酵母膏（glucose peptone yeast extract，GPY）培養(yǎng)基[16]：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏20g，磷酸二氫鉀1g，無水硫酸鎂0.5g，瓊脂20g，蒸餾水1L。

改良木生菌GPY培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，酵母浸膏10 g，磷酸二氫鉀2 g，無水硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L。

固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基[17]：將干燥無腐敗的白樺木粉碎，過40目篩，準確稱取10 g木屑，加入兩倍質(zhì)量的營養(yǎng)液（硫酸銨20 g、磷酸二氫鉀0.8 g、無水硫酸鎂0.4 g、蒸餾水1 L）。

上述培養(yǎng)基pH均自然，滅菌條件為121℃、30 min。

1.1.3 試劑

醋酸、醋酸鈉（分析純）、3,5二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）、葡萄糖（生化試劑）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）快速抽提試劑盒、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、EasyTaq聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）SuperMix：日本Takara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Nanodrop 2000c核酸蛋白測定儀：美國Thermo Fisher公司；2720 Thermal Cycler PCR擴增儀：美國BIO-RAD公司；MLS-3751L-PC高溫蒸汽滅菌器：松下健康醫(yī)療器械株式會社；5418R臺式高速離心機：德國Eppendorf公司；UV9100A紫外分光光度計：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；HWS-250BX恒溫恒濕培養(yǎng)箱、YC-R50恒溫培養(yǎng)搖床：天津泰斯特儀器有限公司；SW-J-2FD超凈工作臺：蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 木霉的分子生物學(xué)鑒定

采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取木霉XLGL 201709100的基因組。利用核酸蛋白測定儀測定其濃度，采用雙蒸水（ddH2O）將樣品母液稀釋至300ng/μL左右，以其為模板，選用正向引物ITS1（5 "-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3） "和反向引物ITS4（5 "-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3） "進行PCR擴增。PCR擴增體系（20 μL）：模板1.0 μL、正向引物和反向引物各1.0 μL、EasyTaqPCR Super Mix 10.0 μL、ddH2O 7.0 μL。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸1 min，共30循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0回收PCR擴增產(chǎn)物，將回收的PCR擴增產(chǎn)物送至北京睿博興科生物科技有限公司進行測序。測序結(jié)果經(jīng)拼接后在美國國立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genebank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源比對，選取同源性較高的菌株，采用MEGA 5.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 木霉固體培養(yǎng)基的篩選

選取純化的木霉菌絲，用接種針挑取表面積為1 cm2的菌絲塊接種于PDA培養(yǎng)基、改良麥粒汁培養(yǎng)基、木生菌GPY培養(yǎng)基、改良木生菌GPY培養(yǎng)基4種固體培養(yǎng)基上，利用直徑為1 cm的打孔器從純化的木霉菌絲培養(yǎng)皿中取長勢相似、大小相同的菌絲塊分別接種于新的4種固體培養(yǎng)基上，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察菌絲生長狀態(tài)并測量記錄菌絲生長速度，至菌絲全部長滿培養(yǎng)皿為止。

將培養(yǎng)完畢的4種固體培養(yǎng)基煮沸使得瓊脂溶解，40目濾網(wǎng)過濾得到菌絲。菌絲于80℃烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量，得到菌絲的生物量。通過比較木霉菌株在4種固體培養(yǎng)基上的生長速度及菌絲生物量篩選獲得最優(yōu)固體培養(yǎng)基。

1.3.3 木霉產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)

液體發(fā)酵培養(yǎng)：用接種針挑取表面積為1 cm2的菌絲塊接種于100 mL PDB液體培養(yǎng)基中，于25℃、150 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)。待菌絲長滿后均勻吸取1 mL菌液于100 mL PDB液體培養(yǎng)基中，于25℃、150 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)3 d，測定酶活。

固體發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的液體菌絲放入40目的滅菌濾篩中過濾得到純菌絲，用無菌水清洗菌絲表面，去除殘留培養(yǎng)基，用滅菌的藥勺將菌絲刮取到滅菌的三角瓶中，加入50 mL無菌營養(yǎng)液，混勻，吸取5 mL至固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于25℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d后測定酶活。

1.3.4 纖維素酶活力的測定[18-19]

粗酶液的制備：將液體發(fā)酵培養(yǎng)液用80目的濾篩過濾，除去菌體后，8 000 r/min條件下離心10 min，得到的上清液即為粗酶液。固體發(fā)酵結(jié)束后，稱取5.0 g酶曲（均勻取樣），加入50 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（0.1 mol/L、pH 4.8），40℃、80 r/min條件下振蕩浸提1.5 h，8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液測定纖維素酶活力。

葡萄糖標準曲線的繪制：分別吸取0、0.1 mL、0.2 mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6 mL葡萄糖標準溶液（1.0 mg/mL）于7支具塞試管中，采用乙酸-乙酸鈉緩沖液（0.1 mol/L、pH 4.8）定容至1.0 mL。分別加入1.0 mL DNS顯色液，沸水中水浴5 min，取出后迅速冷卻，加8 mL蒸餾水，搖勻，于波長520 nm處測定吸光度值。以葡萄糖的毫克數(shù)（x）為橫坐標，OD520nm值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。得到葡萄糖標準曲線為y=2.321x+0.069 8，R2=0.999 3，線性關(guān)系良好，可用于葡萄糖含量的測定。

FPA的測定：取0.5 mL酶稀釋液和0.5 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（0.1 mol/L、pH 4.8）于具塞試管中，放入一張定性濾紙（1 cm×6 cm），50℃水浴保溫1 h，加入1.0 mL DNS顯色液，煮沸5min后迅速冷卻，加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，于波長520 nm處測定吸光度值。以沸水浴處理15 min的0.5 mL粗酶液作為空白對照，計算FPA，其計算公式如下：

式中：A為葡萄糖質(zhì)量，μg；n為稀釋倍數(shù)；m為浸提1 g干酶曲所用緩沖液體積，mL；液體發(fā)酵m默認為1；v為酶液體積，mL；h為反應(yīng)時間，min；180為葡萄糖的摩爾質(zhì)量，μg/μmol。

FPA單位定義[20]：在50℃、pH為4.8的條件下每分鐘所產(chǎn)生1 μmoL的葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株XLGL201709100的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

以真菌ITS1/ITS4為引物進行PCR擴增，菌株XLGL 201709100 ITS基因序列PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

由圖1可知，菌株XLGL201709100 ITS序列PCR擴增產(chǎn)物的堿基長度均在600～700 bp，與預(yù)測結(jié)果相符，說明PCR擴增產(chǎn)物為目的基因。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源比對，選取同源性較高的模式菌株，利用MEGA 5.0中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖1 菌株XLGL201709100 ITS基因序列PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis result of PCR amplification products of ITS gene sequences of strain XLGL201709100

圖2 菌株XLGL201709100 ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain XLGL201709100 based on ITS gene sequences

由圖2可知，菌株XLGL201709100與哈茨木霉（Trichoderma harzianum）聚于一支，同源性最高。因此，鑒定菌株XLGL201709100為一株哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。

2.2 固體培養(yǎng)基的篩選結(jié)果

哈茨木霉XLGL201709100分別在4種固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)0.5 d、1 d、1.5 d、2 d、2.5 和3 d時的生長情況見圖3和表1。

圖3 哈茨木霉XLGL201709100在4種固體培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)Fig.3 Growth state ofTrichoderma harzianumXLGL201709100 on the 4 kinds of solid media

表1 哈茨木霉XLGL201709100菌絲的生長狀況Table1 Mycelia growth situation ofTrichoderma harzianum XLGL201709100

由圖3可知，哈茨木霉XLGL201709100在4種固體培養(yǎng)基上生長迅速，培養(yǎng)48 h后均長滿整個培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿直徑為9.0 cm）。哈茨木霉XLGL201709100在PDA培養(yǎng)基和改良麥粒汁培養(yǎng)基上菌絲生長呈放射性，菌絲層薄，且在改良麥粒汁培養(yǎng)基上，菌落中間有一明顯的環(huán)狀產(chǎn)孢區(qū)，其背面無色或者略黃，正面由黃綠色最終轉(zhuǎn)化為綠色，這與文獻報道的哈茨木霉形態(tài)特征相似[21-22]。哈茨木霉在木生菌GPY培養(yǎng)基和改良木生菌GPY培養(yǎng)基上菌落呈白色，菌絲層厚，呈密集的蛛網(wǎng)狀，產(chǎn)孢區(qū)均形成同心輪紋。造成菌絲形態(tài)不同的原因可能是由于不同培養(yǎng)基之間，營養(yǎng)成分和比例不同，使菌絲形態(tài)之間存在差異。

圖4 哈茨木霉XLGL201709100在4種固體培養(yǎng)基上的生長能力（A）與生物量（B）Fig.4 Growth capacity(A)and biomass(B)ofTrichoderma harzianum XLGL201709100 on the 4 kinds of solid media

以4種固體培養(yǎng)基對其進行培養(yǎng)，觀察并記錄菌絲在固體培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)，并通過菌絲生長能力（圖4A）和培養(yǎng)4 d的菌絲生物量（圖4B）篩選出最適合該木霉菌株生長的固體培養(yǎng)基。

由圖4A可知，木霉培養(yǎng)至2 d時，木生菌GPY培養(yǎng)基與改良木生菌GPY培養(yǎng)基上的皿內(nèi)菌絲已接近全部長滿，但以0.5 d的生長能力來看，該木霉菌株在改良木生菌GPY培養(yǎng)基生長能力最強，而PDA培養(yǎng)基和改良麥粒汁培養(yǎng)基上的菌絲生長略慢，在2.5d時全部長滿培養(yǎng)皿表面。由圖4B可知，木霉菌株培養(yǎng)4 d后，在GPY培養(yǎng)基上的菌絲生物量最大，為0.18 g，而改良麥粒汁培養(yǎng)基菌絲生物量最小，為0.07 g。因此，確定木生菌GPY培養(yǎng)基為適合該木霉菌株生長的最優(yōu)固體培養(yǎng)基。

2.3 纖維素酶活力測定結(jié)果

該木霉菌株在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，F(xiàn)PA較低，為（0.025±0.016）U/mL，分析原因可能是由于培養(yǎng)基中含有葡萄糖成分時，葡萄糖對纖維素酶的產(chǎn)生具有抑制作用，木霉菌株優(yōu)先利用葡萄糖，當葡萄糖耗盡時，才會分泌產(chǎn)生纖維素酶，這與林元山[23]關(guān)于康氏木霉（Trichoderma koningii）誘導(dǎo)、阻遏作用機制的研究相符；此外，ILMéN M等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在瑞氏木霉（Trichoderma reesei）培養(yǎng)物中，當葡萄糖耗盡時，可檢測到纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄，并推測這種機制有利于微生物節(jié)省能量，是基因長期進化的結(jié)果。

木霉菌株在以白樺木木屑為固體產(chǎn)酶基質(zhì)的固體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，F(xiàn)PA達到（1.043±0.093）U/g。目前，對哈茨木霉發(fā)酵產(chǎn)酶的方式有液體發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵兩種，LOPEZ-RAMIREZN等[25]研究并評價了巴西亞馬遜森林9株野生木霉菌的纖維素酶活力，其中哈茨木霉的總纖維素酶活性為1.63 U/mL；姚強等[26]利用液體發(fā)酵方法從堿性土壤中分離得到1株哈茨木霉，其FPA為0.96 U/mL；趙肖玲[27]研究發(fā)現(xiàn)，以秸稈為固態(tài)產(chǎn)酶發(fā)酵原料時，在pH值3.5和25℃條件下培養(yǎng)3 d，哈茨木霉菌株的FPA為1.57 U/g。本文所得哈茨木霉菌種纖維素酶活力接近于平均酶活力水平。

3 結(jié)論

分離自錫林郭勒盟野生白樺林中產(chǎn)纖維素酶的木霉菌株XLGL201709100經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為一株哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。木霉菌落在4種固體培養(yǎng)基上的生長形態(tài)特征不同：木霉在木生菌GPY培養(yǎng)基和改良木生菌GPY培養(yǎng)基上，菌落呈白色，菌絲層厚，呈密集的蛛網(wǎng)狀，產(chǎn)孢區(qū)均形成同心輪紋；在PDA培養(yǎng)基和改良麥粒汁培養(yǎng)基上，菌絲生長呈放射性，菌絲層薄，且在改良麥粒汁培養(yǎng)基上，菌落中間有一明顯的環(huán)狀產(chǎn)孢區(qū)，其背面無色或者略黃，正面由黃綠色最終轉(zhuǎn)化為綠色。其中木生菌GPY培養(yǎng)基為該木霉菌種的最優(yōu)固體培養(yǎng)基。木霉菌株在PDB培養(yǎng)基中發(fā)酵3 d時，F(xiàn)PA為（0.025±0.016）U/mL，而以樺木木屑為固體產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)7 d時，F(xiàn)PA為（1.043±0.093）U/g。