俞春錦

（山東陽谷縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 陽谷 252300）

長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康已經(jīng)產(chǎn)生了巨大危害。利用生物防治菌作為生物殺菌劑的生物防治方法可以有效地克服這些弊端，因而生物農(nóng)藥越來越受到人們的重視。其中拮抗微生物在植物病蟲害生物防治中的應(yīng)用備受人們關(guān)注[1-2]。在目前已發(fā)現(xiàn)的拮抗微生物中，木霉菌（Trichoderma spp.）具有很好的生防活性。

木霉菌（Trichoderma spp.）是防治植物病原真菌病害的重要生防因子。按傳統(tǒng)分類系統(tǒng)，隸屬于半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、絲孢科[3]。木霉適應(yīng)性廣，幾乎在所有種植農(nóng)作物的土壤中都有木霉真菌存在，其廣泛存在于根圍、葉圍、種子和球莖等生態(tài)環(huán)境中[4]。自從Weinding首先發(fā)表了木霉菌對(duì)多種植物病原菌具有拮抗作用以來[5]，目前已研究發(fā)現(xiàn)木霉至少對(duì)18 個(gè)屬29 種植物病原真菌在體外或體內(nèi)表現(xiàn)有拮抗作用，以哈茨木霉的使用最為廣泛。近年來人們發(fā)現(xiàn)，除了在生物防治方面有很重要的作用之外，哈茨木霉還在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性、降低連作障礙等方面有一定的作用[6]。

但是哈茨木霉菌的產(chǎn)量低成為制約哈茨木霉菌發(fā)展應(yīng)用的重要因素。常用的哈茨木霉（T. harzianum）的培養(yǎng)過程為：先通過馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）進(jìn)行一級(jí)培養(yǎng)后，再將孢子洗脫后植入麥麩中進(jìn)行二級(jí)培養(yǎng)，形成麥麩制劑。近年來，對(duì)于哈茨木霉菌的液體培養(yǎng)技術(shù)研究主要集中在二級(jí)培養(yǎng)階段，但是一級(jí)培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)周期長(zhǎng)、成本高，在一定程度上制約了哈茨木霉的規(guī)模生產(chǎn)，同樣需要進(jìn)一步的改進(jìn)和完善[7]。

赤霉素（GA3）最早是從赤霉菌培養(yǎng)基的濾液中分離出的活性物質(zhì)，在植物體內(nèi)具有提高生長(zhǎng)素含量、促進(jìn)細(xì)胞伸張、促進(jìn)細(xì)胞分裂、促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)大的作用[8-11]。

鈣離子是機(jī)體維持各項(xiàng)生理活動(dòng)不可缺少的離子。在動(dòng)物體內(nèi)鈣離子對(duì)于維持細(xì)胞膜兩側(cè)的生物電位、神經(jīng)傳導(dǎo)功能、肌肉伸縮與舒張功能以及神經(jīng)-肌肉傳導(dǎo)功能、激素的作用機(jī)制等方面具有重要作用[12]。在植物生長(zhǎng)方面，鈣離子作為植物細(xì)胞的第二信使，與植物的代謝調(diào)控、極性建立、細(xì)胞伸長(zhǎng)、氣孔關(guān)閉、生長(zhǎng)發(fā)育等很多方面有關(guān)[13-14]。有研究表明，鈣離子能夠促進(jìn)真菌對(duì)一些元素的吸收并能夠促進(jìn)真菌的生長(zhǎng)，因此對(duì)于哈茨木霉菌的生長(zhǎng)應(yīng)有同樣作用[15]。本試驗(yàn)通過在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的GA3和CaCl2，探討了GA3和CaCl2對(duì)哈茨木霉生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基購自遠(yuǎn)慕生物公司、哈茨木霉菌由山東大學(xué)微生物重點(diǎn)試驗(yàn)室提供。

1.2 方法

分別在PDA 培養(yǎng)基中添加GA3和CaCl2的質(zhì)量濃度為 0.1、0.2、0.4、0.8 和 1.2 mg/L，以不添加 GA3和 CaCl2的培養(yǎng)基為對(duì)照（CK）。在無菌操作臺(tái)上，利用直徑為0.392 cm 的打孔器進(jìn)行接種哈茨木霉菌。在無菌人工氣候培養(yǎng)箱中無光25℃下培養(yǎng)，每天進(jìn)行菌落直徑的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA3 對(duì)哈茨木霉菌生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h 后，不同質(zhì)量濃度GA3溶液處理的PDA 培養(yǎng)基造成哈茨木霉菌落直徑大小順序?yàn)椋?.8 mg/L＞0.2 mg/L＞0.1 mg/L＞0.4 mg/L＞1.2 mg/L＞0 mg/L，GA3質(zhì)量濃度為 0.1、0.2 和 0.8 mg/L 時(shí)均可明顯促進(jìn)哈茨木霉菌生長(zhǎng)，其中0.8 mg/L 的GA3處理下哈茨木霉菌的直徑是對(duì)照的1.42 倍，統(tǒng)計(jì)分析表明與對(duì)照相比差異極顯著；質(zhì)量濃度為0.4、1.2 mg/L 時(shí)同樣促進(jìn)哈茨木霉菌落的生長(zhǎng)，但促進(jìn)作用相對(duì)較低。因此，在前24 h，GA3溶液對(duì)促進(jìn)哈茨木霉菌落的最適質(zhì)量濃度為0.8 mg/L，質(zhì)量濃度范圍為 0.4～0.8 mg/L。

培養(yǎng)36 h 后，不同質(zhì)量濃度GA3溶液處理的PDA培養(yǎng)基造成哈茨木霉菌落直徑大小順序?yàn)椋?.2 mg/L＞0.1 mg/L＞0.8 mg/L＞0.4 mg/L＞1.2 mg/L＞0 mg/L，GA3質(zhì)量濃度為0.1 mg/L 和0.2 mg/L 時(shí)均可明顯促進(jìn)哈茨木霉菌生長(zhǎng)速度；0.2 mg/L 的GA3處理下哈茨木霉菌的直徑是對(duì)照的1.35 倍，質(zhì)量濃度為0.4、0.8 mg/L 時(shí)同樣促進(jìn)哈茨木霉菌落的生長(zhǎng)，但促進(jìn)作用相對(duì)較低；各處理與對(duì)照差異極顯著（圖1）。

圖1 GA3 對(duì)哈茨木霉菌落直徑的影響

2.2 CaCl2 對(duì)哈茨木霉菌生長(zhǎng)的影響

CaCl2對(duì)哈茨木霉菌生長(zhǎng)的影響如圖2 所示，試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h 后，不同質(zhì)量濃度鈣離子溶液處理的哈茨木霉菌落直徑大小順序?yàn)椋?.2 mg/L＞0.4 mg/L＞0.8 mg/L＞1.2 mg/L＞0 mg/L＞0.1 mg/L，鈣離子質(zhì)量濃度為0.2 mg/L 時(shí)促進(jìn)哈茨木霉菌生長(zhǎng)速度不明顯，在添加0.2 mg/LCaCl2的平板中菌落直徑僅是對(duì)照的1.04 倍。

圖2 CaCl2 對(duì)哈茨木霉菌落直徑的影響

培養(yǎng)36 h 后，添加了不同質(zhì)量濃度CaCl2的PDA 培養(yǎng)基中哈茨木霉菌落直徑大小順序?yàn)椋?.2 mg/L＞0.1 mg/L＞0.8 mg/L＞0 mg/L＞1.2 mg/L＞0.4 mg/L，鈣離子質(zhì)量濃度為0.2 mg/L 時(shí)可促進(jìn)哈茨木霉菌生長(zhǎng)，此時(shí)培養(yǎng)基中菌落直徑僅為對(duì)照的1.08 倍。鈣離子質(zhì)量濃度為1.2 mg/L和0.4 mg/L 時(shí)可抑制哈茨木霉菌生長(zhǎng)，此時(shí)培養(yǎng)基中菌落直徑比對(duì)照分別減小了0.03 和0.29倍。

3 結(jié)論與討論

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)哈茨木霉菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化進(jìn)行了很多研究。王慧中等[16]通過淺層液體培養(yǎng)技術(shù)對(duì)哈茨木霉菌的最適pH 做了研究，指出了最適pH 在4～6之間；王慧中等[17]利用蟲草頭孢發(fā)酵廢液為母液制成的組合培養(yǎng)液培養(yǎng)哈茨木霉，其培養(yǎng)效果明顯優(yōu)于其他培養(yǎng)液，為工業(yè)化生產(chǎn)哈茨木霉提供了新思路。蔡愛群等[18]對(duì)鈣、鐵和錳對(duì)2 種靈芝液體培養(yǎng)菌絲體生物量影響的研究表明鈣離子對(duì)松杉靈芝在Ca 質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)生物量最高，指出鈣離子對(duì)真菌生長(zhǎng)有一定的影響。

但是固體培養(yǎng)技術(shù)，尤其是關(guān)于植物激素和鈣離子對(duì)哈茨木霉生長(zhǎng)的研究多沒有涉及。本試驗(yàn)是通過不同質(zhì)量濃度的GA3和鈣離子分別對(duì)哈茨木霉菌的固體培養(yǎng)做出研究，通過觀察菌落的直徑來探討其對(duì)哈茨木霉菌生長(zhǎng)的影響，從而揭示植物激素和鈣離子對(duì)哈茨木霉菌是否具有相互作用。為進(jìn)一步研究促進(jìn)哈茨木霉菌產(chǎn)量的培養(yǎng)基提供重要參考。