周建弟，張 蕾，錢(qián) 斌，蔣予箭*，鄒慧君，李智慧，王 蘭

（1.國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興 312000；2.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江 紹興 312000；3.浙江工商大學(xué) 食品與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310012）

黃酒是中國(guó)特有的釀造酒，與啤酒、葡萄酒并稱(chēng)為世界三大發(fā)酵酒。黃酒發(fā)酵方式屬于雙邊發(fā)酵且伴隨著多種微生物共同發(fā)酵，特定的發(fā)酵工藝使黃酒具有獨(dú)特的風(fēng)味特征以及特定的功能性。隨著生活水平的不斷提高，消費(fèi)者的需求目標(biāo)已向健康保健轉(zhuǎn)變，單純的酒種已不能滿(mǎn)足消費(fèi)者的需要。研究表明[1-2]，黃酒中吡嗪類(lèi)、核苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜烯類(lèi)化合物等比較豐富，此外黃酒中游離氨基酸、功能性低聚糖、礦物質(zhì)元素和多酚類(lèi)物質(zhì)含量要明顯優(yōu)于其他酒類(lèi)。黃酒是富含功能性低聚糖的天然飲品，功能性低聚糖具有多種重要的生理功能，因此適量飲用黃酒能起到較好的保健作用[3]。黃酒中富含γ-氨基丁酸，具有提高記憶力、降血壓、活化肝腎及防止動(dòng)脈硬化等功能[4]。

功能性黃酒就是指在生產(chǎn)過(guò)程中添加功能因子后制成的一類(lèi)黃酒，對(duì)人體有一定的保健功能[5]。楊祖滔[6]研究表明，薏米茯苓黃酒中含有豐富的功能性成分，具有較強(qiáng)的抗氧化能力。此外，紅曲黃酒[7]、桑葚黃酒[8]、牡蠣黃酒[9]等新型的功能性黃酒得以被開(kāi)發(fā)，這些新型黃酒適量飲用能夠改善機(jī)體免疫力。閆訓(xùn)友等[10]研究富含冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵液中蟲(chóng)草素的功能性黃酒。趙貝等[11]研究阿魏藥酒表明，抗腫瘤作用可能與其免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用有關(guān)。李鴻儒等[12]研究附子藥酒表明，附子藥酒雖有一定抗腫瘤作用，但同時(shí)對(duì)阻止腫瘤生長(zhǎng)也有不利的方面。近年來(lái)富含中草藥成分的黃酒也被開(kāi)發(fā)出來(lái)，許多學(xué)者對(duì)黃芪甲苷和三七[13-14]、麥冬[15-16]、甘草[17]、五味子[18]等進(jìn)行了大量研究，表明這些中草藥對(duì)提高人體免疫力方面具有很大的作用。因此，功能性黃酒的開(kāi)發(fā)具有很大的前景。

但是具有功能性的黃酒，其功能性表現(xiàn)尚不明確。因此本研究以低度傳統(tǒng)半干紹興黃酒為酒基，加入黃芪、麥冬、五味子、生曬參、甘草中藥提取物，增加皂苷、多糖等功能性成分含量，通過(guò)建立不同的小鼠免疫抑制模型，對(duì)小鼠進(jìn)行功能性黃酒的處理，以說(shuō)明功能性黃酒對(duì)提高機(jī)體免疫力的作用，為開(kāi)發(fā)新型的功能性黃酒提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中藥材（黃芪、五味子、生曬參、麥冬、甘草）：杭州東仁堂醫(yī)藥零售十號(hào)大街店；清潔級(jí)美國(guó)癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠（體質(zhì)量（20±2）g）：浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心；紹興黃酒（酒精度15%vol）：浙江古越龍山紹興酒股份有限公司；環(huán)磷酰胺：上海生工生物工程股份有限公司；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒：上海邦奕生物科技有限公司；細(xì)胞裂解液：國(guó)家黃酒工程技術(shù)中心；磷酸緩沖液：國(guó)家黃酒工程技術(shù)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

BW3200S電子天平：上海精密儀器儀表有限公司；5910R高速冷凍離心機(jī)：艾本德中國(guó)有限公司；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀：碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司；DFY-200C小型粉碎機(jī)：上海利聞科學(xué)儀器有限公司；FE30 pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 功能性黃酒制作

將實(shí)驗(yàn)用中藥材在40℃烘干至恒質(zhì)量，將其粉碎至40目大小均勻顆粒。稱(chēng)取黃芪20 g、五味子4 g、生曬參20 g、麥冬8 g、甘草8 g，將藥材以1∶1.5（g∶mL）的料液比，利用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇在37℃條件下浸提12 h，并在70℃的條件下回流5h，經(jīng)過(guò)濾、在溫度50℃條件下進(jìn)行真空濃縮，用紹興黃酒作為酒基，用浸提液勾兌成8度的功能性黃酒，測(cè)定功效成分含量，并進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 小鼠建模實(shí)驗(yàn)

將小鼠飼養(yǎng)在潔凈的環(huán)境中，環(huán)境溫度穩(wěn)定在（22±2）℃，保持12 h的白天和夜晚循環(huán)飼養(yǎng)，經(jīng)過(guò)1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后進(jìn)行相關(guān)的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。取60只ICR小鼠，12只一組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

建模組和給藥組小鼠進(jìn)行環(huán)磷酰胺[19-20]建模處理，模型1：腹腔注射環(huán)磷酰胺，劑量80 mg/kg體質(zhì)量，連續(xù)注射3 d，在試驗(yàn)的第11、12、13天，皮下注射環(huán)磷酰胺，劑量80 mg/kg體質(zhì)量。在試驗(yàn)的第21、22、23天后再?gòu)?qiáng)化一次，即皮下注射環(huán)磷酰胺，劑量80 mg/kg體質(zhì)量。模型2：腹腔注射環(huán)磷酰胺劑量40 mg/kg體質(zhì)量連續(xù)7 d，停用環(huán)磷酰胺3 d，然后再用以同樣的方法強(qiáng)化（即腹腔注射環(huán)磷酰胺劑量40 mg/kg體質(zhì)量連續(xù)7 d，停用環(huán)磷酰胺3 d）。

給藥實(shí)驗(yàn)，于環(huán)磷酰胺實(shí)驗(yàn)處理后分別于第9、10、11天和第19、20、21天后再?gòu)?qiáng)化一次。每周稱(chēng)質(zhì)量一次，記錄死亡情況。按體質(zhì)量進(jìn)行給藥（功能性黃酒喂食），各組給藥劑量為小鼠體質(zhì)量×10 mL/kg，給藥30 d。

1.3.3 分析檢測(cè)

（1）小鼠體質(zhì)量的測(cè)定

通過(guò)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行處理，每星期對(duì)小鼠進(jìn)行稱(chēng)質(zhì)量，記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

（2）小鼠免疫器官的測(cè)定

末次給藥24 h后，脊椎脫臼處死小鼠，及時(shí)取出小鼠的胸腺、脾臟、腎臟、肝臟，生理鹽水沖洗后，用濾紙吸干水分，進(jìn)行稱(chēng)質(zhì)量，按下列公式計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、肝臟指數(shù)：

式中：I為胸腺指數(shù)/脾臟指數(shù)/腎臟指數(shù)/肝臟指數(shù)；W1為胸腺/脾臟/腎臟/肝臟質(zhì)量，mg；W0為小鼠體質(zhì)量，g。

（3）小鼠血漿中免疫球蛋白M含量測(cè)定

動(dòng)物眼眶采血，放在非抗凝血試管中，室溫靜置2 h后，2 500 r/min離心10 min，取上清，測(cè)定免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）。采用ELISA法進(jìn)行測(cè)定，具體操作均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)處理。

（4）小鼠血漿中T細(xì)胞分型的測(cè)定

動(dòng)物眼眶采血，放在抗凝血試管中，按說(shuō)明書(shū)處理后，流式細(xì)胞儀測(cè)定T淋巴細(xì)胞亞細(xì)胞群分化簇3（cluster of differentiation3，CD3）、分化簇 4（cluster of differentiation 4，CD4），分化簇 8（cluster ofdifferentiation8，CD8）。具體步驟如下：取500 μL血漿至細(xì)胞流式管，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，靜置10 min，然后加入磷酸鹽緩沖液至流式管頂部，2 000 r/min離心10 min。棄去上清液，再次加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，靜置10 min，然后加入磷酸鹽緩沖液至流式管頂部，2 000 r/min離心10 min?？醇t細(xì)胞裂解程度，是否需要再次裂解。全程放在低溫環(huán)境中操作。最后一次棄去上清液，沉淀加入100微升磷酸鹽緩沖液，各加10 μLCD3、CD4、CD8鼠抗人熒光單克隆抗體，4℃避光放置30 min。然后加入磷酸緩沖液至流式管刻度稍微以下，2 000 r/min離心10 min。離心結(jié)束后，棄去上清液，再加入100 μL的磷酸緩沖液。通過(guò)熒光單克隆抗體對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行定性、定量，在流式細(xì)胞儀上計(jì)數(shù)1×105個(gè)/kg以上細(xì)胞，分別記錄T淋巴細(xì)胞（CD3+），輔助誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4+），抑制細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD3+CD8+）以及T輔助細(xì)胞/T抑制細(xì)胞（CD4+/CD8+）表達(dá)的陽(yáng)性率。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Origin 8.5軟件、Excel和SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行作圖和差異顯著性分析。所有的數(shù)據(jù)都以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，P＜0.05時(shí)表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能性黃酒成分

功能性黃酒是指以黃酒為基酒，通過(guò)添加特定中草藥成分的萃取濃縮液而形成的一種新型黃酒，使其能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力，改善人體亞健康，但不以治療為目的[5]。黃芪、麥冬、甘草、生曬參、五味子均記載于《中國(guó)藥典》[21]，且允許用于保健食品。通過(guò)《中國(guó)藥典》推薦攝入量查詢(xún)以及問(wèn)詢(xún)中醫(yī)，確定了功能性黃酒的基本配方見(jiàn)表1。

表1 人體推薦攝入量和功能性黃酒配方Table1 Recommended intake and functionalHuangjiuformula

依據(jù)表1功能性黃酒配方，對(duì)該功能性黃酒中的功效成分進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)已有的檢測(cè)方法[22-25]，進(jìn)行總皂苷、總多糖、總多酚、總黃酮的含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 功能性黃酒中功效成分含量Table2 Content of functional components in functionalHuangjiu

由表2可知，功能性黃酒中含有皂苷、多糖、多酚及黃酮等功效成分。

2.2 小鼠建模結(jié)果

通過(guò)環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑建立免疫抑制模型的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)小鼠進(jìn)行建模處理，建立不同的免疫抑制模型以驗(yàn)證不同處理組的免疫提升效果，建模結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 小鼠建模及處理方法Table3 Modeling and treatment methods of mice

由表3可知，空白對(duì)照組：8度空白黃酒；模型組1：在造?；A(chǔ)上，喂食8度空白黃酒；模型組2：在造?；A(chǔ)上，喂食8度空白黃酒；給藥組1（模型組1+藥物）：在造模基礎(chǔ)上，喂食藥酒。藥酒酒精度8度，生藥量0.91 g/mL；給藥組2（模型組1+藥物）：在建模基礎(chǔ)上，喂食藥酒。藥酒酒精度8度，生藥量0.91 g/mL。

2.3 不同造模模型對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

小鼠體質(zhì)量變化是小鼠免疫力的最直觀的體現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)30 d后，對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行稱(chēng)質(zhì)量，每周小鼠的體質(zhì)量變化見(jiàn)表4。

由表4可知，從第二周開(kāi)始造模組小鼠的體質(zhì)量均低于空白組小鼠體質(zhì)量，存在顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明通過(guò)環(huán)磷酰胺處理，小鼠的免疫功能遭到抑制，實(shí)驗(yàn)建模成功。對(duì)比給藥1組和給藥2組可知，在給藥1組的條件下，免疫恢復(fù)效果要好于給藥2組。且給藥2組與模型組相比，體質(zhì)量反而減少，可能是由于模型2組造模程度太深，這與宋雁等[19]研究結(jié)果相似。

表4 不同建模模型對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Table4 Effects of different modeling models on body mass of mice

2.4 不同建模模型對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是與免疫相關(guān)的主要臟器指數(shù)[26-27]。實(shí)驗(yàn)30 d后，對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，取下小鼠的脾臟、胸腺、肝臟和腎臟進(jìn)行稱(chēng)質(zhì)量，結(jié)果分別見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 不同建模模型對(duì)小鼠胸腺和肝臟指數(shù)的影響Fig.1 Effects of different modeling models on thymus and liver indexes of mice

圖2 不同建模模型對(duì)小鼠腎臟與脾臟指數(shù)的影響Fig.2 Effects of different modeling models on kidney and spleen indexes of mice

由圖1和圖2可知，模型1組和給藥1組的胸腺指數(shù)與空白組相比，分別降低了54.27%和46.34%，并且存在顯著性差異（P＜0.05）；模型2組和給藥2組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)與空白組相比，脾臟指數(shù)分別增加了157.25%和113.99%，胸腺指數(shù)分別降低了24.34%和41.46%，并且存在顯著性差異（P＜0.05）。給藥1組和模型1組相比，給藥組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)分別增加了28.78%和17.33%，說(shuō)明給藥組較模型組對(duì)小鼠的免疫器官有改善作用，且趨勢(shì)靠近空白組；給藥2組和模型2組相比，給藥組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)無(wú)顯著性變化（P＞0.05），但是都有一定程度的降低，分別降低了17.17%和25.01%，并且趨勢(shì)遠(yuǎn)離空白組。造模組的肝臟指數(shù)和腎臟指數(shù)與空白組相比，無(wú)明顯變化（P＞0.05）。綜上結(jié)果表明，在模型1的基礎(chǔ)上，給藥組對(duì)小鼠的免疫器官具有一定的改善作用；在模型2的基礎(chǔ)上，給藥組對(duì)小鼠的免疫器官無(wú)改善作用。這說(shuō)明小鼠的免疫機(jī)制破壞程度加大，給藥組已失去提高免疫力的作用。

2.5 不同建模模型對(duì)小鼠血漿中免疫球蛋白M含量的影響

免疫球蛋白M（IgM）主要分布在血液中，在機(jī)體免疫反應(yīng)中出現(xiàn)最早，具有強(qiáng)大的抗感染作用。不同造模模型對(duì)小鼠血漿中IgM含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同建模模型對(duì)小鼠血漿中免疫球蛋白的影響Fig.3 Effects of different modeling models on immunoglobulin in mice plasma

由圖3可知，造模組與空白組相比，小鼠血漿中免疫球蛋白M含量分別降低了50.37%、38.21%、162.90%、和69.25%，并且存在顯著性差異（P＜0.05）。給藥1組的IgM含量與模型1組相比，增加了24.49%，說(shuō)明給藥組較模型組對(duì)小鼠的免疫器官有改善作用，且趨勢(shì)靠近空白組；給藥2組的I gM含量與模型2組相比，減少了19.16%，不存在顯著性差異（P＞0.05）。綜上所述，在模型1的基礎(chǔ)上，給藥組對(duì)小鼠產(chǎn)IgM具有一定的調(diào)節(jié)作用；在模型2的基礎(chǔ)上，給藥組對(duì)小鼠產(chǎn)IgM無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用。

2.6 不同造模模型對(duì)小鼠血漿中T細(xì)胞分型的影響

通過(guò)實(shí)驗(yàn)分別對(duì)T淋巴細(xì)胞（CD3+），輔助誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（CD3+CD4+），抑制細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CD3+CD8+）以及T輔助細(xì)胞/T抑制細(xì)胞（CD4+/CD8+）進(jìn)行測(cè)定，不同造模模型對(duì)小鼠血漿中T細(xì)胞分型的影響結(jié)果分別見(jiàn)圖4和圖5。

圖4 不同造模模型對(duì)小鼠血漿中T細(xì)胞分型（CD3+、CD3+CD4+）的影響Fig.4 Effect of different modeling models on T cell typing(CD3+、CD3+CD4+)in mice plasma

圖5 不同造模模型對(duì)小鼠血漿中T細(xì)胞分型（CD3+CD8+、CD4+/CD8+）的影響Fig.5 Effect of different modeling models on T cell typing(CD3+CD8+、CD4+/CD8+)in mice plasma

由圖4可知，與空白組相比，模型1組、給藥1組、模型2組、給藥2組的CD3+CD4+含量分別增加了7.45%、6.44%、6.72%和8.46%，并且存在極顯著性差異（P＜0.01）。由圖5可知，與空白組相比，模型1組、給藥1組、模型2組、給藥2組的CD3+CD8+含量分別降低了22.08%、19.53%、30.27%和32.23%，并且存在極顯著性差異（P＜0.01）；與空白組相比，模型1組、給藥1組、模型2組、給藥2組的CD4+/CD8+比值分別增加了34.07%、27.88%、46.46%和54.42%，并且存在極顯著性差異（P＜0.01）。給藥1組的CD3+含量、CD3+CD4+含量、CD3+CD8+含量、CD4+/CD8+比值與模型1組相比，分別降低了0.94%，增加了3.27%，降低了4.62%，雖然都不存在顯著性差異（P＞0.05），但是給藥組數(shù)據(jù)更接近空白組；給藥2組的CD3+含量、CD3+CD4+含量、CD3+CD8+含量、CD4+/CD8+比值與模型2組相比，分別增加了1.63%，減少了2.81%，增加了5.44%，但是都不存在顯著性差異（P＞0.05）。

結(jié)果表明，在模型1的基礎(chǔ)上，給藥組對(duì)小鼠血漿中T細(xì)胞分型含量具有一定的調(diào)節(jié)作用；在模型2的基礎(chǔ)上，給藥組對(duì)小鼠血漿中T細(xì)胞分型含量沒(méi)有明顯的調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)論

通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的體質(zhì)量、免疫器官指數(shù)、血漿中免疫球蛋白M、血漿中T細(xì)胞分型等指標(biāo)對(duì)小鼠建模模型進(jìn)行驗(yàn)證。與空白組相比，兩個(gè)模型組小鼠的體質(zhì)量、免疫器官指數(shù)、免疫球蛋白M、血漿中T細(xì)胞含量都有顯著性的變化，說(shuō)明本試驗(yàn)的兩個(gè)建模成功。給藥1組與模型1組相比，免疫器官指數(shù)增加，IgM含量增加，CD4+/CD8+比值降低，且給藥組的數(shù)據(jù)較模型組更接近于空白組，說(shuō)明給藥組對(duì)小鼠免疫具有一定的調(diào)節(jié)作用；給藥2組與模型2組相比，體質(zhì)量降低，免疫器官指數(shù)降低，IgM含量降低，CD4+/CD8+比值增加，說(shuō)明造模程度深，小鼠的免疫調(diào)節(jié)能力破壞大，無(wú)法恢復(fù)。但是通過(guò)給藥1組和模型1組的數(shù)據(jù)對(duì)比，可以驗(yàn)證得到該配方具有調(diào)節(jié)免疫力的功能。綜上，本研究免疫功能調(diào)節(jié)驗(yàn)證試驗(yàn)探索出了較優(yōu)造模模型，即模型組1。并且由模型組1的建模試驗(yàn)結(jié)果證明，功能性黃酒具有提高機(jī)體免疫力的功能。