范俊甫,李軍生,李蔭展 ,王倩倩,黃國霞,閻柳娟
(1.廣西科技大學(xué)廣西糖資源綠色加工重點實驗室,廣西 柳州 545006;2.廣西高通食品科技有限公司,廣西 柳州 545100)
【研究意義】雖然某些含有呋喃香豆素類化合物的食品或者藥物是人類的膳食來源或?qū)θ梭w有諸多醫(yī)療作用,但可能對人體存在一些潛在的健康風(fēng)險。事實上,呋喃香豆素的光敏活性早已被認(rèn)可。在沒有光照的條件下,呋喃香豆素也可以通過分子間的一些弱作用力如氫鍵和范德華力插入到DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中[1]。最新研究表明,口服含有呋喃香豆素類化合物的藥物可以迅速被人體血液吸收[2],而且大量食用富含呋喃香豆素的食物可能與更高的黑色素瘤、基底細(xì)胞癌與鱗狀上皮細(xì)胞癌發(fā)病率有關(guān)[3-4]。因此,呋喃香豆素類化合物的潛在健康風(fēng)險問題值得進一步研究[5],發(fā)展新的、快速簡便的、低成本的、針對呋喃香豆素類化合物潛在風(fēng)險評價的試驗方法以及此類化合物潛在風(fēng)險的控制對人類健康具有重要意義。【前人研究進展】呋喃香豆素類化合物在自然界中分布廣泛,如在傘形科、蕓香科、豆科等植物中均存在,在醫(yī)學(xué)上通常用于治療皮膚病和其他疾?。?]。花椒毒素,一種來源于植物的線型呋喃香豆素,可從各種藥用植物中提取,如歐防風(fēng)的果實,可用作治療銀屑病和白癜風(fēng)[6]。花椒毒酚,常見于傘形科植物如蛇床、白芷等,具有抗菌、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、保護缺血腦組織等作用[7]。香檸檬烯,在佛手柑精油、其他柑橘精油[8]、葡萄柚汁[9]及無花果、歐芹等其他植物中均有發(fā)現(xiàn),是一種天然的抗腫瘤藥物[10]。補骨脂素和異補骨脂素可以從豆科植物補骨脂的果實提取,具有抗癌、防止骨質(zhì)疏松和治療皮膚病等多種功效[11]。由于這些天然組分也廣泛存在于一些常見的傘形科、蕓香科、豆科果蔬中,因此,近年來,人們越來越關(guān)注其因過量食用可能對人體健康帶來不利的影響和潛在的危害。
【本研究切入點】1961年Lerman發(fā)現(xiàn),吖啶分子具有嵌入DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的能力,此后又對DNA與平面芳香族化合物的作用進行了大量研究,提出了具有平面芳香稠環(huán)結(jié)構(gòu)的分子可以與DNA以一種嵌入結(jié)合的方式發(fā)生相互作用的結(jié)合模式,并提出了DNA嵌入劑的理論,而這種理論也被許多環(huán)芳烴分子所證實[12-13]。呋喃香豆素大多具有平面剛性結(jié)構(gòu),通常,線型呋喃香豆素分子會與DNA的兩條鏈形成鏈間交聯(lián),而非線型的則只會與DNA形成單加合物[14]。因此在某種程度上可能會導(dǎo)致DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制受到阻礙或抑制,因此。呋喃香豆素可能存在毒性和導(dǎo)致基因突變,對人體健康存在一定風(fēng)險?!緮M解決的關(guān)鍵問題】通過共振光散射技術(shù)研究了5種呋喃香豆素類分子與DNA相互作用,通過計算其對應(yīng)的DNA結(jié)合飽和值,并以典型的DNA嵌入劑溴化乙錠作為參考標(biāo)準(zhǔn),以此快速評價藥物潛在風(fēng)險。
大腸桿菌由廣西科技大學(xué)微生物實驗室提供。DNA儲備溶液:將適量鯡魚精DNA(Herring Sperm DNA,美國sigma公司)溶于50 mL的3次蒸餾水中,保存于0~4 ℃冰箱。根據(jù)朗伯比爾定律確定DNA儲備液的濃度?;ń范舅?、香檸檬烯、花椒毒酚均為北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品,分別用1,2-丙二醇、乙醇、二甲基亞砜配制成一定濃度的溶液,使用時稀釋至所需濃度。異補骨脂素、補骨脂素和溴化乙錠為北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品,均采用3次蒸餾水配成一定濃度的溶液,使用時稀釋至所需濃度。使用pH7.40的Britton-Robinson(BR)緩沖溶液控制反應(yīng)體系的pH值。其他試劑均為分析純,所用水均為3次蒸餾水。 F-320熒光分光光度計(天津港東科技發(fā)展股份有限公司);UV-2102 PC型紫外可見分光光度計(上海儀器有限公司)。
1.2.1 大腸桿菌DNA中殘留呋喃香豆素類分子的共振散射光譜測定 在液體培養(yǎng)基中接種大腸桿菌,于37 ℃搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h,均勻分裝在5個40 mL錐形瓶中,分別編號1~5號,在2~5號錐形瓶中加入2.50×10-3mol/L的溴化乙錠、花椒毒素、香檸檬烯和花椒毒酚,搖勻,以1號為對照。每30 min從5個錐形瓶中取等量的大腸桿菌提取大腸桿菌DNA。8.5 h后,把提取出來的大腸桿菌DNA分別用TE懸浮,測其在260 nm處的吸光值。根據(jù)朗伯比爾定律,確定DNA濃度,并使所有DNA濃度調(diào)成一致。于F-320熒光分光光度計上設(shè)置λem=λex,狹縫寬度均為5 nm,掃描速度1 200 nm/min,PMT 600V,靈敏度8.0 s,進行同步掃描,獲得共振散射光譜。
1.2.2 呋喃香豆素類分子與DNA作用的共振散射光譜測定 向10 mL比色管加入3 mL一定濃度的溴化乙錠溶液,進行同步掃描。再用一定濃度的DNA溶液滴定,每次用旋渦混合器混勻,靜置40 min消除氣泡,進行同步掃描,獲得共振散射光譜。用同樣方法獲得香檸檬烯、花椒毒酚、補骨脂素、異補骨脂素分別與DNA作用的共振散射光譜圖。反應(yīng)條件均為常溫、pH7.40。儀器參數(shù)與1.2.1一致。
對于呋喃香豆素類化合物,不同的藥物分子與DNA的結(jié)合位置與結(jié)合位點數(shù)量可能也有所不同。根據(jù)本實驗室先前提出的DNA結(jié)合飽和值概念[15],可用藥物分子濃度與達到飽和時DNA濃度之比表示:
通過共振散射光譜推算出藥物的DNA結(jié)合飽和值(DNA-BSV),DNA-BSV越大,藥物與DNA的結(jié)合能力越強,其潛在風(fēng)險越大,并以溴化乙錠的DNA-BSV作為參考,以此評價藥物潛在風(fēng)險。
本試驗分別測得不同時間大腸桿菌內(nèi)花椒毒素、香檸檬烯、花椒毒酚和溴化乙錠進入并與大腸桿菌DNA作用后,大腸桿菌DNA的共振散射(RLS)信號變化(圖1)。前4 h,與空白對照相比,溴化乙錠、花椒毒素、香檸檬烯、花椒毒酚與大腸桿菌DNA的RLS信號變化甚微。在此階段,大腸桿菌細(xì)胞膜均比較完整,使藥物進入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)較為困難,難與DNA發(fā)生相互作用,或少量的藥物進入到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi),因此RLS信號強度與空白對照差別不明顯。當(dāng)大腸桿菌與藥物分子作用時長達到5.5 h后,花椒毒酚、香檸檬烯、花椒毒素、溴化乙錠的RLS信號逐一增強,且與溴化乙錠作用的大腸桿菌DNA的散射共振信號較明顯的高于花椒毒素、香檸檬烯、花椒毒酚;隨著相互作用的時間不斷增加,一部分大腸桿菌的細(xì)胞膜不斷遭到破壞,進入到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的藥物分子開始不斷與大腸桿菌DNA發(fā)生作用,而空白對照基本無明顯變化。當(dāng)作用時間達到8.5 h后,大腸桿菌DNA與花椒毒酚、香檸檬烯、花椒毒素、溴化乙錠作用的光譜信號均明顯高于空白對照,且溴化乙錠與大腸桿菌DNA作用的光譜信號明顯高于其與花椒毒酚、香檸檬烯、花椒毒素的共振信號。在這期間,大腸桿菌的細(xì)胞膜完整性較差,大量的藥物分子進入到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)與大腸桿菌DNA結(jié)合,且與溴化乙錠作用的DNA共振散射光譜信號最強。空白對照RLS信號強度變化不明顯。
圖1 呋喃香豆素類分子與大腸桿菌作用不同時間的大腸桿菌DNA的共振散射信號Fig. 1 Resonance light scatting signals of Escherichia coli DNA at different time for furocoumarin molecules' interaction with E. coli
本試驗運用共振散射光譜法研究了溴化乙錠、花椒毒素、香檸檬烯、花椒毒酚、補骨脂素以及異補骨脂素與DNA的相互作用。如圖2所示,溴化乙錠在360、580 nm處出現(xiàn)兩個共振散射峰,在360 nm處的共振散射峰比較穩(wěn)定且靈敏,逐漸往1.138×10-5mol/L的溴化乙錠溶液中加入DNA,在DNA濃度從0增加到0.73×10-6mol/L的過程中,溴化乙錠的RLS信號逐漸增強;DNA的濃度超過0.73×10-6mol/L,溴化乙錠的共振散射信號不再增強而趨于平衡甚至有逐漸降低的趨勢。其他5種呋喃香豆素類化合物如補骨脂素、異補骨脂素,花椒毒素,香檸檬烯,花椒毒酚分別與DNA相互作用的RLS光譜均出現(xiàn)了類似結(jié)果(圖3~圖7)。說明這些呋喃香豆素分子具有類似溴化乙錠和DNA結(jié)合的模式。
圖2 溴化乙錠與DNA相互作用共振散射光譜Fig. 2 Resonance light scatting spectra of the interaction between ethidium bromide and DNA
圖3 補骨脂素與DNA相互作用共振散射光譜Fig. 3 Resonance light scatting spectra of the interaction between psolaren and DNA
圖4 異補骨脂素與DNA相互作用共振散射光譜Fig. 4 Resonance light scatting spectra of the interaction between isopsolaren and DNA
圖5 香檸檬烯與DNA相互作用共振散射光譜Fig. 5 Resonance light scatting spectra of the interaction between bergapten and DNA
圖6 花椒毒素與DNA共振散射光譜Fig. 6 Resonance light scatting spectra of the interaction between xanthotoxin and DNA
圖7 花椒毒酚與DNA相互作用共振散射光譜Fig. 7 Resonance light scatting spectra of the interaction between xanthotoxo and DNA
選取溴化乙錠為參照,研究5種呋喃香豆素分子與DNA的結(jié)合飽和值,并與溴化乙錠的作比較。通過結(jié)合飽和值來快速簡便地評價平面結(jié)構(gòu)分子的潛在風(fēng)險。事實上,對于呋喃香豆素類化合物,不同藥物分子與DNA的結(jié)合位置與結(jié)合位點數(shù)量也有所不同。DNA在一定濃度范圍內(nèi)使共振散射信號逐漸增強,共振散射信號的增強說明溶液中有加合物的形成;DNA濃度超過一定范圍,藥物分子共振散射信號不再增強或者有下降趨勢,說明藥物與DNA反應(yīng)達到平衡。因此,根據(jù)4種呋喃香豆素類化合物溴化乙錠的RLS光譜圖,溴化乙錠、花椒毒素、香檸檬烯、花椒毒酚、異補骨脂素和補骨脂素與DNA作用的DNA 結(jié)合飽和值如表1所示。
表1 在pH 7.40的體系中藥物與DNA的結(jié)合飽和值Table 1 DNA binding saturation values for drug molecules binding with DNA at pH7.40
盡管應(yīng)用于PUVA治療的呋喃香豆素類化合物,在治療某些皮膚疾病方面非常有用,但也有報道證實呋喃香豆素類與紫外線輻射聯(lián)合使用具有致癌作用[16],而且還有報道表明食品中存在的呋喃香豆素類化合物也增加了患皮膚癌的風(fēng)險[1]。早在 1993年,Pasternack等[17]就建立了共振散射光譜技術(shù),這種技術(shù)常被用于研究大分子與小分子之間的相互作用,具有靈敏度高、操作簡便和快速高效的優(yōu)點。通過共振散射光譜法研究花椒毒素、香檸檬烯、花椒毒酚進入大腸桿菌DNA的能力。本研究結(jié)果表明,這3種藥物分子均可以或部分可以進入到大腸桿菌細(xì)胞內(nèi),并與大腸桿菌DNA結(jié)合,且其進入大腸桿菌的能力相差不大,花椒毒素和香檸檬烯進入大腸桿菌的能力比花椒毒酚略遜一籌。這5種呋喃香豆素體外與DNA共振散射光譜研究結(jié)果表明,5種呋喃香豆素類化合物如補骨脂素、異補骨脂素,花椒毒素,香檸檬烯,花椒毒酚與DNA相互作用均出現(xiàn)了與溴化乙錠類似的RLS光譜特征,說明這些呋喃香豆素分子與溴化乙錠和DNA結(jié)合模式也類似。溴化乙錠是一種典型的DNA嵌入劑,是劇毒的致癌物且早已被證實[18],因為它可以平行地嵌入到雙鏈DNA的堿基對之間[19],導(dǎo)致DNA構(gòu)象發(fā)生改變,形成穩(wěn)定的溴化乙錠-DNA加合物[20],從而對DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄造成一定程度的影響[21]。有些呋喃香豆素類分子即使在沒有紫外線照射下也會展現(xiàn)出光敏活性而與DNA堿基對進行反應(yīng)形成鏈間交聯(lián)[7]。補骨脂素和異補骨脂素都是典型的DNA嵌入劑,與DNA相互作用均屬嵌插模式,事實上,這些呋喃香豆素類分子與溴化乙錠在結(jié)構(gòu)上都具有一定的相似性。因此,我們推測花椒毒素,香檸檬烯,花椒毒酚與DNA相互作用也與嵌插模式有關(guān)。通過共振散射光譜法并結(jié)合DNA結(jié)合飽和值,預(yù)測藥物分子與DNA之間的結(jié)合能力,藥物的DNA結(jié)合飽和值的值越大,說明藥物分子與DNA結(jié)合能力越強,其潛在風(fēng)險也越大。這幾種藥物分子與DNA結(jié)合飽和值大小分別為:溴化乙錠> 異補骨脂素/補骨脂素> 花椒毒酚> 香檸檬烯> 花椒毒素,說明這幾種呋喃香豆素類分子的潛在風(fēng)險:異補骨脂素/補骨脂素> 花椒毒酚> 香檸檬烯> 花椒毒素。DNA 結(jié)合飽和值與藥物DNA結(jié)合能力的強度成正相關(guān)。細(xì)胞培養(yǎng)實驗結(jié)果表明這些呋喃香豆素分子能夠進入大腸桿菌DNA,可以推測它們也可能被人體吸收而進入DNA,因此呋喃香豆素分子的確存在一定風(fēng)險。
通過共振光散射法測定藥物DNA結(jié)合飽和值,以此來評價藥物潛在風(fēng)險,具有操作簡單、成本低、檢測周期短的優(yōu)點,對發(fā)展新的藥物潛在風(fēng)險評價的方法具有一定的參考價值。然而,為了降低藥物在使用過程中的潛在風(fēng)險,還有許多因素影響藥物與DNA結(jié)合能力,如溫度、pH、離子強度、其他環(huán)境共存物等,值得進一步深入探討,因此通過共振光散射法結(jié)合DNA結(jié)合飽和值,評價和調(diào)控藥物潛在風(fēng)險將會是接下來的研究方向。
通過共振散射光譜法檢測到大腸桿菌DNA共振信號隨時間逐漸增強,說明花椒毒素、香檸檬烯、花椒毒酚3種呋喃香豆素類化合物是可以進入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi),并與其DNA發(fā)生相互作用,可以推測人體吸收呋喃香豆素會進入其DNA并發(fā)生某些鏈間交聯(lián)作用,因此存在一些風(fēng)險。鑒于溴化乙錠、異補骨脂素和補骨脂素均為DNA嵌入劑,它們的RLS信號變化十分相似,可以推測花椒毒素、香檸檬烯、花椒毒酚與DNA相互作用方式可能也是嵌插方式。此外,在體外pH7.40環(huán)境中,5種藥物與DNA的結(jié)合飽和值分別為:0.74(補骨脂素)、0.74(異補骨脂素)、0.24(花椒毒酚)、0.18(香檸檬烯)、0.17(花椒毒素),分別相當(dāng)于溴化乙錠的4.75%、4.75%、1.54%、1.15%、1.09%。它們的DNA 結(jié)合飽和值遠小于溴化乙錠,略小于異補骨脂素/補骨脂素。其潛在風(fēng)險由大到小依次為:異補骨脂素/補骨脂素、花椒毒酚、香檸檬烯、花椒毒素。藥物分子與DNA結(jié)合飽和值的大小反映了其與DNA結(jié)合能力的大小,DNA結(jié)合飽和值越大,與DNA結(jié)合的能力越強,其潛在風(fēng)險越大。這5種呋喃香豆素類分子潛在風(fēng)險較小,但仍具有一定風(fēng)險,可能對人體健康存在某些負(fù)面作用,在食品安全研究及藥物藥理研究的過程中應(yīng)值得注意。