宋凌元，涂翰卿，周昊天，趙 巖，趙金良，筴金華，張艷紅，任炳琛

（1. 上海海洋大學(xué)/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心/水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.河北中捷羅非魚國家級(jí)良種場，河北 滄州 061108）

【研究意義】隨著我國對(duì)淡水資源保護(hù)力度加大，淡水水域養(yǎng)殖的空間逐漸被壓縮，而內(nèi)陸的鹽堿水資源較為豐富，由于這類鹽堿水域中離子組成復(fù)雜而且具有高鹽、高堿和高pH等特點(diǎn)，不適用于一般的水產(chǎn)養(yǎng)殖。因此，開發(fā)培育耐鹽堿性較強(qiáng)的羅非魚品種對(duì)維持水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展意義重大。【前人研究進(jìn)展】目前，尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）因其較強(qiáng)的適應(yīng)性和較快的生長速度，在羅非魚養(yǎng)殖中占據(jù)主導(dǎo)地位［1-2］，同時(shí)被認(rèn)為是耐鹽堿養(yǎng)殖品種培育的優(yōu)良材料［3-8］。有研究表明，未經(jīng)馴化的尼羅羅非魚可以耐受的最高鹽度為18［9］，經(jīng)過鹽度馴化的尼羅羅非魚可以生存在鹽度為32的咸水中［10］。【本研究切入點(diǎn)】農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自2012年開展尼羅羅非魚耐鹽堿馴化與選育試驗(yàn)，對(duì)不同品系尼羅羅非魚基礎(chǔ)群體在鹽堿水環(huán)境下的脅迫和生長進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明，尼羅羅非魚可以耐受一定范圍的鹽度、堿度，且能在鹽堿水域中進(jìn)行養(yǎng)殖［11］。在基礎(chǔ)群體中篩選出耐鹽堿性狀優(yōu)良、生長迅速的個(gè)體作進(jìn)一步的選育工作，2013—2014年分別獲得了鹽堿選育F1代和F2代，選育F1代和F2代鹽堿耐受性比基礎(chǔ)選育群體有所提升，且各世代間的鹽堿耐受性呈現(xiàn)上升趨勢［12-16］。2015年和2017—2018年分別獲得耐鹽堿選育F3、F4、F5代?！緮M解決關(guān)鍵問題】本研究擬通過急性致死實(shí)驗(yàn)對(duì)選育F3、F4、F5代魚苗的半致死濃度進(jìn)行測定與比較分析，為選育各世代鹽堿耐受性提供數(shù)據(jù)，以期為尼羅羅非魚耐鹽堿選育積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年7月，分別選取本實(shí)驗(yàn)室保種的選育F2、F3和F4尼羅羅非魚作為親本，繁育出F3、F4和F5魚苗，挑選活力高、規(guī)格相似（1 g左右）的個(gè)體進(jìn)行急性鹽度試驗(yàn)、急性堿度試驗(yàn)和鹽堿混合試驗(yàn)。

急性鹽度試驗(yàn)的不同梯度使用養(yǎng)殖場鹽鹵池內(nèi)的鹽鹵水混合地下井水調(diào)制；急性堿度試驗(yàn)的不同梯度按比例將碳酸氫鈉溶解在地下井水配制；鹽堿混合試驗(yàn)用水的配制需要先用鹽鹵水調(diào)好鹽度，然后按比例溶入碳酸氫鈉。各試驗(yàn)組濃度梯度配制完成后靜置2～3 d，取上清備用。試驗(yàn)用水溫度在23.6～25.2 ℃之間，參照涂翰卿等［17］的方法調(diào)控pH 值約8.5，溶氧在5.5～7.8 g/L之間，這些指標(biāo)均處于尼羅羅非魚安全范圍內(nèi)［18］。試驗(yàn)用水鹽度用 WYY-I 型光學(xué)折射鹽度計(jì)測量，水溫使用精確度為0.1℃的水銀溫度計(jì)測量。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在室內(nèi)400 L塑料桶中進(jìn)行。對(duì)供試的F3、F4和F5代魚苗單鹽急性試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)鹽度梯度（21、22、23、24、25、26 g/L，記為 S21、S22、S23、S24、S25和S26）；單堿急性試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)堿度梯度（2、4、6、8、10、12 g/L，記為A2、A4、A6、A8、A10和A12）；鹽堿混合試驗(yàn)設(shè)置鹽度（10、15、20 g/L）、堿度（2、4、6 g/L）之間相互組合產(chǎn)生9個(gè)試驗(yàn)組（S10A2、S10A4、S10A6、A15A2、S15A4、S15A6、S20A2、S20A4和S20A6）。每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)放入150條受試魚苗，試驗(yàn)開始前2 d停止投喂，試驗(yàn)期間不投喂餌料、不換水，連續(xù)充氣，保證溶氧充足。

試驗(yàn)期間每天記錄受試魚種死亡數(shù)量，以鰓蓋停止活動(dòng)、外來刺激無反應(yīng)判別為死亡［19］。

式中，LC50為半致死濃度；XK為最大濃度對(duì)數(shù)；C為相鄰濃度比值的對(duì)數(shù)；Pi、Pi+1為各試驗(yàn)組的死亡率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算F3、F4和F5代魚苗在不同鹽度、堿度、鹽堿混合濃度梯度中96 h的半致死濃度，以P＜0.05作為差異顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性鹽度試驗(yàn)

急性鹽度試驗(yàn)開始時(shí)，受試魚苗出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為體色發(fā)白，游動(dòng)緩慢。隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，F(xiàn)3代受試魚苗在各鹽度試驗(yàn)組中均有死亡出現(xiàn)，隨著鹽度的提高死亡率也隨之升高，在S25試驗(yàn)組中受試魚苗在48 h內(nèi)死亡率達(dá)到97%，在S26試驗(yàn)組中受試魚苗在24 h內(nèi)死亡率達(dá)到94%；F4、F5受試魚苗在S21和S22試驗(yàn)組中逐漸適應(yīng)，累計(jì)死亡率較低或無死亡；S23、S24、S25鹽度試驗(yàn)組受試魚苗24 h內(nèi)累計(jì)死亡率較高，隨后累計(jì)死亡率上升趨勢逐漸減緩；S26試驗(yàn)組中受試魚苗幾乎在48 h內(nèi)全部死亡（圖1）。選育F3、F4和F5代魚苗的鹽度半致死濃度分別為22.473、24.468、23.833 g/L，F(xiàn)4和F5代魚苗急性鹽度耐受性較F3代有所提高。

圖1 鹽度脅迫下不同時(shí)間尼羅羅非魚F3、F4和F5代魚苗死亡率Fig. 1 Mortality rate of F3, F4 and F5 generations of Nile tilapia at different time under salinity stress

2.2 急性堿度試驗(yàn)

急性堿度試驗(yàn)中，A2、A4和A6堿度試驗(yàn)組受試魚苗影響較小并很快適應(yīng)，A10、A12堿度試驗(yàn)組受試魚苗應(yīng)激反應(yīng)較大，表現(xiàn)為活動(dòng)能力下降，對(duì)外界刺激感知緩慢。在A2、A4和A6堿度試驗(yàn)組中，F(xiàn)3、F4和F5代受試魚苗96 h內(nèi)無死亡出現(xiàn)，A12堿度試驗(yàn)組的受試魚苗96 h內(nèi)全部死亡，F(xiàn)3、F4和F5代受試魚苗在A8堿度試驗(yàn)組中48 h內(nèi)累計(jì)死亡率較高，但隨著試驗(yàn)進(jìn)行，適應(yīng)后累計(jì)死亡率上升趨勢趨于平緩（圖2）。選育F3、F4和F5代魚苗的堿度半致死濃度分別為8.256、8.443、8.453 g/L，F(xiàn)4和F5代魚苗堿度耐受性差異不大，略高于F3代。

圖2 堿度脅迫下不同時(shí)間尼羅羅非魚F3、F4和F5代魚苗死亡率Fig. 2 Mortality rate of F3, F4 and F5 generations of Nile tilapia at different time under alkalinity stress

2.3 鹽堿混合試驗(yàn)

鹽堿混合試驗(yàn)S10A2、S10A4和S10A6試驗(yàn)組中，受試魚苗幾乎不受影響，S15A2、S15A4、S15A6、S20A2、S20A4和S20A6試驗(yàn)組中，受試魚苗受鹽堿脅迫影響較大，但S15A2、S15A4逐漸適應(yīng)。S10A2、S10A4和S10A6試驗(yàn)組中F3、F4和F5代受試魚苗96 h內(nèi)無死亡出現(xiàn)；S15A2試驗(yàn)組中F3和F4代受試魚苗96 h內(nèi)累計(jì)死亡率較低，F(xiàn)5受試魚苗適應(yīng)較快，96 h內(nèi)未見死亡出現(xiàn)；S20A4和S20A6試驗(yàn)組中F3、F4和F5代受試魚苗在24 h內(nèi)累計(jì)死亡率較高，96 h內(nèi)受試魚苗全部死亡；F3、F4和F5代受試魚苗在相同鹽度下都呈現(xiàn)死亡率隨堿度上升而升高的趨勢（圖3）。在中鹽度（S15）鹽堿混合試驗(yàn)組中，F(xiàn)3、F4和F5代魚苗的堿度半致死濃度分別為4.612、4.538、4.883 g/L，F(xiàn)5代在同一鹽度條件下對(duì)堿度的耐受性高于F3和F4代。而在高鹽度（S20）鹽堿試驗(yàn)組中，F(xiàn)3、F4和F5代魚苗堿度半致死濃度分別為1.861、1.875、1.782 g/L，各世代間差異不顯著。

3 討論

本研究中，在鹽度急性脅迫下，尼羅羅非魚選育F3、F4和F5代魚苗的鹽度半致死濃度分別為22.473、24.468、23.833 g/L，F(xiàn)5代與F4代間差異不顯著，同時(shí)顯著高于F3代。與前期各選育世代相比，選育F3、F4和F5代魚苗的鹽度半致死濃度高于基礎(chǔ)選育群體（17.994 ～19.616 g/L）［12］、選育 F1代（21.625 ～21.628 g/L）［13］、選育 F2代（21.809 g/L）［14］。而李學(xué)軍等［20］在不同種類羅非魚耐鹽性研究結(jié)果中得出，尼羅羅非魚的96 h半致死鹽度為14.9 g/L，說明經(jīng)過鹽堿選育后的尼羅羅非魚對(duì)鹽度的耐受能力得到了提高。通過各世代急性鹽度試驗(yàn)結(jié)果比較，鹽堿選育群體的鹽堿耐受性逐代均得到了提高，但隨著世代增加，鹽度耐受性表現(xiàn)趨于穩(wěn)定。

急性堿度脅迫下，尼羅羅非魚選育F3、F4和F5代魚苗的堿度半致死濃度分別為8.256、8.443、8.453 g/L，F(xiàn)3、F4和F5代魚苗間差異不顯著。除了與基礎(chǔ)選育群體（7.648 ～7.777 g/L）［12］差異顯著外，選育F3、F4和F5代魚苗的堿度半致死濃度與選育 F1代（7.903 ～8.407 g/L）［13］和選育 F2代（8.514 g/L）［14］間差異不顯著。說明鹽堿選育對(duì)提升尼羅羅非魚各世代的堿度急性脅迫耐受能力作用不明顯。

一般認(rèn)為，鹽堿對(duì)魚類的脅迫并不是單一因子作用，而是綜合作用的結(jié)果［21-22］。研究表明，高鹽度下彭澤鯽幼魚的堿度耐受性低于低鹽度下的堿度耐受性，這也表明鹽堿混合條件下，鹽度與堿度間存在聯(lián)合毒性作用，其毒性比單鹽、單堿更大［23］。本研究中，選育F3、F4和F5代魚苗在低鹽堿混合S10A2、S10A4和S10A6試驗(yàn)組中活動(dòng)正常，未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)；當(dāng)鹽度升高到15、20 g/L時(shí)，隨著堿度的增加，F(xiàn)4、F5代魚苗體色加深，游動(dòng)、反應(yīng)緩慢，死亡增加，也說明鹽、堿之間存在一定的協(xié)同作用。在低鹽度（S10）鹽堿混合試驗(yàn)中，S10A2、S10A4和S10A6組內(nèi)均未魚苗死亡情況，而基礎(chǔ)群體（10 g/L鹽度下堿度半致死濃度為 3.108 ～4.377 g/L）［12］、選育F1代（5.577 ～6.096 g/L）［13］和選育 F2代（5.925 g/L）［14］中都有死亡出現(xiàn)，表明在低鹽度下鹽堿選育對(duì)羅非魚堿度耐受性效果明顯提高；在中鹽度（S15）鹽堿混合試驗(yàn)組中，F(xiàn)3、F4和F5代魚苗的堿度半致死濃度分別為4.612、4.538、4.883 g/L，明顯高于基礎(chǔ)群體（15 g/L鹽度下堿度半致死濃度為2.144 ～2.183 g/L）［12］，但與選育F1代（3.940 ～4.794 g/L）［13］、 選 育 F2代（4.583 g/L）［14］間無明顯差異；而在高鹽度（S20）鹽堿試驗(yàn)組中，F(xiàn)3、F4和F5代魚苗堿度半致死濃度分別為1.861、1.875、1.782 g/L，與選育F1代（20 g/L鹽度下堿度半致死濃度為1.778 g ～1.943 g/L）［13］和選育 F2代（1.897 g/L）［14］相比，差異均不明顯。

圖3 鹽堿混合脅迫下不同時(shí)間尼羅羅非魚F3、F4和F5代魚苗死亡率Fig. 3 Mortality rate of F3, F4 and F5 generations of Nile tilapia at different time under salinity-alkalinity stress

4 結(jié)論

綜合尼羅羅非魚耐鹽堿選育各世代的鹽堿耐受性表現(xiàn)，我們初步認(rèn)為，相對(duì)堿度而言，鹽堿選育對(duì)鹽度耐受性提高更為明顯；在混合鹽堿條件下，低鹽度下的鹽堿選育效果明顯優(yōu)于中、高鹽度；隨選育世代增加，尼羅羅非魚鹽堿耐受性能表現(xiàn)趨于穩(wěn)定。