羅國芝，吳慧芳，譚洪新

(1.上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；3.水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306)

氮(N)是魚蝦體內(nèi)核苷酸、蛋白質(zhì)、氨基酸的主要構(gòu)成元素之一。魚蝦的蛋白質(zhì)需求高但消化吸收能力有限，相當(dāng)一部分投喂飼料中的氮不能被利用。開放式養(yǎng)殖系統(tǒng)中未被利用的氮素被排放到周圍水環(huán)境。封閉循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中通常利用固液分離去除掉殘餌和糞便(約占投喂飼料的30%～60%)，其余未被利用的氮素以有機(jī)氮、氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮的形式存在于養(yǎng)殖水體中[1]。氨氮是蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物之一，對水生動物有明顯毒害作用，是養(yǎng)殖過程中主要控制的水質(zhì)指標(biāo)之一[2]。

養(yǎng)殖水體中主要有三種氨氮轉(zhuǎn)化途徑：藻類和水生植物進(jìn)行的光合自養(yǎng)、硝化細(xì)菌進(jìn)行的自養(yǎng)硝化和異養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行的同化過程[3]。光合自養(yǎng)過程需要光照和較大的占地面積[2]。異養(yǎng)同化過程需要維持較高的有機(jī)物含量(C/N>20， w/w)[3]，而養(yǎng)殖水體C/N常小于2(w/w)[4]，需要加入有機(jī)物補(bǔ)充碳源。自養(yǎng)硝化過程是最普遍的一種氨氮轉(zhuǎn)化方式，由CO2提供碳源，適宜于處理C/N較低的養(yǎng)殖水體[3]。

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)通過固液分離裝置、固定膜式生物過濾器等水處理技術(shù)實(shí)現(xiàn)高密度養(yǎng)殖用水的重復(fù)利用。固定膜式生物過濾器的核心功能就是提供自養(yǎng)硝化細(xì)菌生長和代謝所需條件，將水體中氨氮經(jīng)亞硝酸氮轉(zhuǎn)化成硝酸氮[1]。本文根據(jù)國內(nèi)外關(guān)于固定膜式自養(yǎng)硝化過程的研究報(bào)道，結(jié)合循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的水體特征，分析了利用固定膜式自養(yǎng)硝化過程控制養(yǎng)殖水體氨氮的優(yōu)勢和劣勢、在實(shí)際使用過程中的注意事項(xiàng)以及應(yīng)用方式，為實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 自養(yǎng)硝化過程

2 自養(yǎng)硝化細(xì)菌

自養(yǎng)硝化過程的氨氧化階段和亞硝酸氧化階段分別由氨氧化細(xì)菌(也被稱為亞硝酸細(xì)菌)或氨氧化古菌和硝酸化細(xì)菌進(jìn)行。常說的硝化細(xì)菌包括氨氧化細(xì)菌和硝酸細(xì)菌。 硝化細(xì)菌屬化能自養(yǎng)型，生長效率和代謝效率比較慢。異養(yǎng)細(xì)菌的生長速率和繁殖速率分別是自養(yǎng)硝化細(xì)菌的5倍和2～3倍[3]。 異養(yǎng)細(xì)菌的特殊生長率為4.8/d，氨氧化細(xì)菌和亞硝酸氧化細(xì)菌的特殊生長率只有0.76 和 0.84/d[5]。

2.1 氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌

氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌都能氧化氨氮獲取能量而生長，氨氧化單胞菌生長較快(世代時(shí)間7～8 h)、可以忍受高濃度氨氮(高于100 mmol/L)和亞硝酸(25 mmol/L)(純培養(yǎng)條件下)[6]。越來越多的研究證明氨氧化古菌比氨氧化細(xì)菌要更加豐富。在封閉式養(yǎng)蝦系統(tǒng)中古菌的氨氧化基因比細(xì)菌中的氨氧化基因要豐富[7]。氨氧化古菌 (CandidatusNitrosopumilusmaritimus)和氨氧化細(xì)菌(Nitrosospira)是海水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物過濾器中優(yōu)勢菌種[8](表1)。

表1 循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中生物過濾器中的硝化作用相關(guān)的細(xì)菌[7]Tab.1 Micro-organisms associated with recirculation aquaculture systems biofiltration

2.2 硝酸化細(xì)菌

一般認(rèn)為，硝化作用的速率由硝酸化細(xì)菌決定，硝酸化細(xì)菌一直被認(rèn)為只能依賴于其他微生物供應(yīng)亞硝酸鹽，對環(huán)境變化的反應(yīng)要比氨氧化細(xì)菌敏感，耐低氧能力要比氨氧化細(xì)菌弱[9]。 大于0.01～1 mg/L的NH3和0.06～0.85 mg/L左右的HNO2-N對硝酸化細(xì)菌有抑制作用[10]。

3 循環(huán)水養(yǎng)殖水體中影響自養(yǎng)硝化過程的因素

循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中為了保證養(yǎng)殖對象的存活，氨氮和亞硝酸氮濃度保持在較低水平(氨氮低于3 mg/L，亞硝酸氮低于1.5 mg/L)[1]，不至于到抑制硝化細(xì)菌的程度。光照對自養(yǎng)硝化過程有抑制作用[11]。循環(huán)水一般都是在室內(nèi)，光照不至于強(qiáng)到對自養(yǎng)硝化過程抑制的程度。在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，溫度、鹽度、pH、藥物等是需要重點(diǎn)考慮的影響硝化過程的因子。

3.1 溫度

溫度是細(xì)菌的生長率關(guān)鍵決定因子之一，0～30 ℃條件下細(xì)菌都能維持一定的活性。在零下5 ℃的環(huán)境中也分離得到了氨氧化細(xì)菌[12]。高溫條件容易導(dǎo)致細(xì)菌死亡，低溫條件下細(xì)菌經(jīng)過一段時(shí)間的適應(yīng)也可能夠獲得較高活性，但繁殖率降低。所以低溫條件下生物過濾器的啟動時(shí)間較長。在溫度低于5 ℃的條件下，即使培養(yǎng)時(shí)間長達(dá)3～4個(gè)月，硝化作用仍無法正常進(jìn)行，9～26 ℃則會出現(xiàn)硝化作用。淡水系統(tǒng)以25～30 ℃最佳，海水硝化細(xì)菌以27～28 ℃最適宜[13]。但養(yǎng)殖水體溫度的設(shè)定主要取決于養(yǎng)殖對象的需求，冷水性循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中的自養(yǎng)硝化過程需要重點(diǎn)關(guān)注。

3.2 鹽度

鹽度是影響硝化效率的重要因子，氨氧化細(xì)菌對鹽度增加有較高的敏感性，高鹽度條件下，硝酸化細(xì)菌對鹽度的敏感性要比氨氧化細(xì)菌明顯[14-15]，所以海水生物濾器啟動過程中亞硝酸鹽積累的時(shí)間要比氨氮積累的時(shí)間長[16]。海水細(xì)菌經(jīng)過馴化后能夠在較低鹽度條件下存活，把海水換成淡水之后未見其活性停止[17]。淡水養(yǎng)殖系統(tǒng)中硝化作用的活性因?yàn)榧尤牒Ｋ档?，鹽度升高到與正常海水相同時(shí)完全停止。鹽度抑制硝化細(xì)菌的生長速率，也會改變細(xì)菌的生存策略，有鹽度條件下，細(xì)菌會通過調(diào)整細(xì)胞質(zhì)的滲透壓適應(yīng)環(huán)境；從能量代謝的角度，在有鹽度條件下，細(xì)菌生存能耗較高，硝化細(xì)菌從同化代謝中獲得的能量本就有限，鹽度的存在會使硝化細(xì)菌的能量獲取更加有限[18]。

不同鹽度條件下生物膜的氨氧化細(xì)菌和硝酸化細(xì)菌的組成不同。淡水移動床生物膜反應(yīng)器的生物膜中的氨氧化細(xì)菌包括亞硝化單胞菌屬和亞硝化菌屬，硝酸化細(xì)菌則主要為硝化螺菌屬[19]。海水移動床生物膜反應(yīng)器中的亞硝化單胞菌屬和硝酸化細(xì)菌主要為硝化螺菌屬[20]。咸淡水和海水生物過濾器中都存在亞硝化單胞菌屬和亞硝化螺菌屬[21]。亞硝化球菌只出現(xiàn)在咸淡水環(huán)境中，而嗜鹽的亞硝化單胞菌屬只在海水條件下，兩種條件下硝酸化細(xì)菌均包括硝化菌屬和硝化螺菌屬。淡水、20%咸淡水和全海水的移動床生物膜反應(yīng)器的生物膜菌群組成差異明顯：咸淡水的組成豐度比淡水和海水都要低；亞硝化單胞菌屬是氨氧化細(xì)菌的主要菌屬；淡水中硝酸細(xì)菌主要為硝化菌屬和硝化螺菌屬，咸淡水和海水中是硝化螺菌屬[22]。

3.3 溶解氧

硝化細(xì)菌為好氧細(xì)菌，低于60%飽和度的溶解氧會降低氨氮去除率[10]。溶解氧低于4 mg/L時(shí)，亞硝化單胞菌的活性降低，低于2 mg/L時(shí)，硝酸化菌的活性降低[23]。溶解氧太高對硝化細(xì)菌有抑制作用[24]。一般認(rèn)為，生物過濾器中溶解氧最低濃度應(yīng)保持在2 mg/L以上[3]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖水體是富氧水體，為了維持養(yǎng)殖對象的生存，需要保證4 mg/L以上的溶解氧含量，所以生物過濾器進(jìn)水中的溶解氧不會成為限制因子。但在實(shí)際使用過程中，某些類型的生物過濾器(比如浸沒式或者滴濾式)體積比較大，水力停留時(shí)間較長，很難保證生物過濾器內(nèi)部的溶解氧的充足供應(yīng)，需要對反應(yīng)器充氧以保證溶解氧在2 mg/L以上。

3.4 pH和堿度

純培養(yǎng)條件下，亞硝化單胞菌和硝酸化菌最適宜生長的pH分別是8.1和7.9，在非純培養(yǎng)條件下的結(jié)果可能會有所不同[25]。pH在6.6時(shí)，氨氧化細(xì)菌和亞硝酸氧化細(xì)菌的生長率相等，pH低于6時(shí)AOB的活性很明顯降低，亞硝酸氧化細(xì)菌對低pH的適應(yīng)能力要高于氨氧化細(xì)菌[26]。氨氧化細(xì)菌的活性隨著pH的升高而升高，pH值在 5.0～8.5之間時(shí)每升高1.0，硝化效率提高13%[27]。

維持適宜的堿度水平對硝化過程至關(guān)重要，40 mg CaCO3/L被認(rèn)為是能夠進(jìn)行自養(yǎng)硝化的最低堿度水平，堿度從115 CaCO3mg/L (pH 7.3) 降低至57 CaCO3mg/L(pH 6.7) 時(shí)，生物過濾器的硝化效率減少約50%[28]。Chen 等[29]認(rèn)為在水交換較低的條件下，水體中的堿度應(yīng)維持在200 mg CaCO3/L以上。堿度低的時(shí)候，pH波動比較明顯，微生物結(jié)構(gòu)也不穩(wěn)定，氨氮和亞硝酸去除效率會降低。

3.5 溶解性有機(jī)物和C/N

硝化細(xì)菌屬于典型的自養(yǎng)細(xì)菌，有機(jī)物對于硝化細(xì)菌是否具有毒害作用是人們普遍爭論的問題。在一定的C/N范圍內(nèi)，隨著C/N的升高，硝化作用效率降低，超過一定的范圍，C/N對硝化作用的影響不明顯[30]。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中溶解有機(jī)碳以腐殖酸為主，細(xì)菌可利用性程度比較低，即使C/N高出了自養(yǎng)細(xì)菌的適宜范圍，在固液分離正常運(yùn)轉(zhuǎn)的情況下，對硝化作用效率的影響不大[31]。也有研究者認(rèn)為，有機(jī)物對硝化細(xì)菌可能沒有毒害作用，而是刺激異養(yǎng)細(xì)菌迅速生長，從而與硝化細(xì)菌競爭溶解氧、氨和微量營養(yǎng)物質(zhì)，使硝化細(xì)菌的生長受到限制[32]。有機(jī)物的存在刺激異養(yǎng)細(xì)菌的生長，異養(yǎng)菌的同化降低了參與自養(yǎng)硝化過程的氨氮的利用率，異養(yǎng)細(xì)菌的聚集會抑制氨氧化過程[33]。循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中固液分離會除掉大部分的殘餌和糞便，水體中C/N一般2以下[2]，對硝化細(xì)菌的影響不明顯。

3.6 藥物及有毒物質(zhì)

臭氧生成的氧化物( OPO)在濃度大于 0.05 mg/L的條件下對生物過濾器硝化作用有明顯抑制作用，在初始濃度0.6 mg/L的OPO 中暴露1 h，氨氧化細(xì)菌和硝酸細(xì)菌仍有硝化活性[34]。

養(yǎng)殖系統(tǒng)中會使用一些魚藥等化學(xué)制劑，應(yīng)該考慮這些化學(xué)藥劑是否對生物過濾器中的細(xì)菌有抑制和殺傷作用。1.0 mg/L的過乙酸對硝化過程有短暫的影響，100 mg/L的過氧化氫對硝化過程去除氨氮的能力有明顯的抑制作用，需要10 d才能恢復(fù)，35 mg/L的過氧化氫對硝化過程的影響需要2 d恢復(fù)，即使很小劑量的硫化氫也會影響硝化過程的效率[35]。生物膜會對硝化細(xì)菌起到一定保護(hù)，常用劑量的大多數(shù)魚藥不會對海水生物過濾器造成明顯影響，即使有，也能較短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)[36]。

4 自養(yǎng)硝化過程的建立

生物反應(yīng)器的啟動是常規(guī)的步驟，自養(yǎng)硝化過程的啟動尤其必要，一方面使濾料表面微生物大量繁殖生長，形成生物膜，高效地凈化廢水，另一方面使濾料生物膜的微生物群能逐漸適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。建立完整的硝化作用需要有一定的啟動時(shí)間，21～26 ℃時(shí)需要28～60 d，低溫或者海水環(huán)境需要的時(shí)間更長，鹽度為35的海水建立完整的硝化作用需要75 d左右，28～30 g/L的鹽度、18 ℃水溫的條件下建立硝化過程需要70 d，海水養(yǎng)殖系統(tǒng)甚至2～3個(gè)月都比較常見[17，37]。如果硝化過程沒有被完整建立，中間通過換水減少氨氮和亞硝酸的積累而不是通過自養(yǎng)硝化過程自身完成氨氮或亞硝酸的轉(zhuǎn)化，在運(yùn)行過程中氨氮或者亞硝酸會一直有積累。如果完成了硝化作用的建立過程，在設(shè)計(jì)負(fù)荷內(nèi)生物過濾器會保持穩(wěn)定的處理能力，養(yǎng)殖系統(tǒng)正常運(yùn)行過程中基本不會出現(xiàn)氨氮或者亞硝酸的明顯積累。

4.1 自養(yǎng)硝化過程的建立

首先要保證為硝化細(xì)菌的生長和存活盡可能提供最適宜條件，啟動過程中需要提供自養(yǎng)硝化過程需要的溫度、溶解氧、pH、堿度，還需要提供3～5 mg/L的氨氮?？杉尤胩妓釟溻c維持150 mg CaCO3/L左右的堿度以滿足亞消化單胞菌細(xì)菌的生長，亞硝化單胞菌細(xì)菌需要200～250 mg CaCO3/L的堿度，硝化菌屬穩(wěn)定后堿度可以適當(dāng)降低。堿度合適的條件下，pH可以維持在6.8～7.2。培養(yǎng)過程中加入有機(jī)物能夠促進(jìn)濾料表面微生物繁殖，微生物的繁殖進(jìn)一步促進(jìn)有機(jī)物的分解與吸附。硝化細(xì)菌適應(yīng)低溫的能力較強(qiáng)，適應(yīng)后也能具有高效的硝化能力?？梢酝ㄟ^逐漸提高鹽度的方法加快海水處理系統(tǒng)的生物過濾器的建立。

除了滿足硝化細(xì)菌需要的環(huán)境理化因子需求外，添加商業(yè)的硝化細(xì)菌是否能促進(jìn)自養(yǎng)硝化過程的建立存在爭議。有研究結(jié)果表明添加商業(yè)硝化細(xì)菌可以明顯促進(jìn)硝化作用的建立和效率[38]。但也有研究表明，添加商業(yè)硝化菌并沒有促進(jìn)海水生物過濾器的啟動[16]。

實(shí)際生產(chǎn)過程中也可以不進(jìn)行生物過濾器的預(yù)先培養(yǎng)，直接飼養(yǎng)養(yǎng)殖動物，稱為“冷啟動”。在養(yǎng)殖寶石鱸(Scortumbarcoo)的系統(tǒng)中直接培養(yǎng)生物過濾器需要37 d，啟動過程中亞硝酸鹽積累到20 mg/L以上，氨氮、亞硝酸氮波動明顯；生物過濾器功能建立后，即使中后期投餌量大量增加，系統(tǒng)中水質(zhì)情況一直保持良好狀態(tài)[39]。需要注意的是，選擇采用“冷啟動”方法時(shí)要重點(diǎn)考慮養(yǎng)殖對象的種類，比如羅非魚(Oreochromisniloticus)可以，但虹鱒(Oncorhynchusmykiss)就存在較大風(fēng)險(xiǎn)。

4.2 硝化過程建立成功的標(biāo)準(zhǔn)

培養(yǎng)中的生物膜系統(tǒng)中微生物群的數(shù)量及其活性達(dá)到某一程度(一般情況下，生物膜的厚度達(dá)到1.2～2.2 mm)，微生物的氨化、亞硝化、硝化同時(shí)進(jìn)行，可認(rèn)為培養(yǎng)過程完成。當(dāng)出現(xiàn)下列情況時(shí)，可以作為生物濾器生物膜成熟的判定：處于不斷上升的亞硝酸鹽驟然下降(圖1)[40]，出水中氨氮和亞硝酸保持較低濃度，硝酸鹽明顯積累。

圖1 生物過濾器啟動氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮的變化趨勢Fig.1 The changes of TAN， nitrite-N and nitrate-N during the acclimation period of a bead filter

5 展望

自養(yǎng)硝化過程是目前循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中最常用的氨氮控制途徑，結(jié)合養(yǎng)殖水體的特點(diǎn)，需注意以下幾點(diǎn)：應(yīng)用過程中應(yīng)首先進(jìn)行完整硝化過程的建立；硝酸細(xì)菌比氨氧化細(xì)菌對環(huán)境更敏感，因此系統(tǒng)中容易出現(xiàn)亞硝酸鹽的積累；需要定期補(bǔ)充堿度；溫度、鹽度、pH、堿度、溶解氧是影響硝化作用處理養(yǎng)殖水體的主要因素；生物過濾器啟動完成后會獲得比較穩(wěn)定的處理效能。

為了獲得更高效的應(yīng)用自養(yǎng)硝化過程控制養(yǎng)殖水體中的氨氮，需要開展以下研究：水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中能夠穩(wěn)定進(jìn)行硝化過程的細(xì)菌種類，硝化功能基因的表達(dá)水平的決定因素以及古菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體硝化過程的作用效率和機(jī)理等。