張 松，喬自林，馬桂蘭，劉麗霞，王家敏，侯蘭新

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2. 西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030，3.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅 蘭州 730010)

MDCK細胞(犬腎細胞，Madin-Darby canine kidney cells，MDCK)系是1958年由Madin等從美國的一頭Cocker Spanie母曲架犬的腎臟組織中分離得到的[1]。MDCK細胞呈上皮細胞樣，容易培養(yǎng)、增殖快、貼壁生長，也可馴化為懸浮培養(yǎng)，可連續(xù)傳代[2].大量研究表明，MDCK細胞對多種不同亞型的流感病毒株敏感.病毒用MDCK細胞培養(yǎng)的產(chǎn)量高等特點，可以用來代替雞胚用于疫苗的生產(chǎn)[3-6]。MDCK單克隆細胞是本實驗室由MDCK工作庫細胞通過有限稀釋法所制備，共制備114株.不同的MDCK單克隆細胞株在生長特性上有較大的差異.

本研究前期通過有限稀釋法將MDCK細胞進行單克隆化，獲得了自建MDCK單克隆細胞庫，庫內(nèi)共有114株單克隆細胞.現(xiàn)通過復(fù)蘇MDCK單克隆細胞，統(tǒng)計細胞復(fù)蘇活率、生長狀態(tài)、生長速度和生長形態(tài)等特性，確定MDCK單克隆細胞庫的可用性，旨在為后期篩選病毒敏感的MDCK單克隆細胞實驗提供資源和理論參考，為流感疫苗的生產(chǎn)提供參考.

1 材料和方法

1.1 MDCK單克隆細胞

MDCK單克隆細胞由本實驗利用MDCK工作庫細胞(MDCK-W-63)通過有限稀釋法篩選獲得，共114株.

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶和PBS(蘭州百靈生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(蘭州民海生物有限公司)；臺盼藍(廣州展晨生物科技有限公司).

1.3 主要儀器設(shè)備

CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊公司)、生物倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)科技有限公司)、潔凈操作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司).

1.4 細胞培養(yǎng)

將儲存于液氮罐中的MDCK單克隆細胞取出，在37 ℃水中快速融化后置于50 cm2培養(yǎng)瓶中，補加培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清)，再置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待MDCK細胞生長至致密單層時，PBS液清洗，倒出PBS后加入5 mL 0.25%胰酶，緩慢搖動細胞培養(yǎng)瓶，使胰酶充分沒過細胞表面，將細胞放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)消化5 min取出，在顯微鏡下觀察.當細胞全部變圓并開始脫落時棄去胰酶，在37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)放置3 min后取出，并倒去胰酶加入15 mL DMEM培養(yǎng)基.將細胞吹打混勻后按1∶4比例傳代，將細胞繼續(xù)放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.5 細胞復(fù)蘇活率

待細胞復(fù)蘇后，將細胞懸液50 uL加入PE管中，加入50uL 0.5% 臺盼藍染液，染色2～3 min.吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片，鏡下取任意視野細胞計數(shù).死細胞能被臺盼藍染上色，鏡下可見深藍色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀.細胞活率 =(未著色細胞數(shù)/總細胞)×100%.

1.6 細胞生長速度、狀態(tài)

如1.4中所述進行細胞復(fù)蘇并培養(yǎng)至單層致密，將細胞密度調(diào)整為5×104個/mL傳代細胞.將細胞置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞兩次.統(tǒng)計MDCK單克隆細胞長滿需要的時間，以評價細胞生長速度.通過觀察細胞的邊緣清晰程度、整齊程度與大小差異來評價細胞生長狀態(tài).

1.7 細胞的生長形態(tài)

如1.4中所述復(fù)蘇細胞，將細胞置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細胞兩次.觀察細胞復(fù)蘇貼壁后細胞的生長形態(tài)并統(tǒng)計細胞生長形態(tài)的種類.

2 結(jié)果

2.1 MDCK單克隆細胞的復(fù)蘇活率

MDCK單克隆細胞庫內(nèi)114株MDCK單克隆細胞株復(fù)蘇后，細胞最低活率為92.1%，最高活率為97.3%，平均活力為0.954 ±0.016，高于制備MDCK單克隆細胞所使用的工作庫細胞.

2.2 MDCK單克隆細胞的生長狀態(tài)和速度

MDCK單克隆細胞庫內(nèi)114株細胞，2 d長滿的細胞株為70株，占61.4%；3 d長滿的35株，占30.7%；4 d長滿5株，占4.4%；超過4 d長滿的4株，占3.5%. 細胞生長狀態(tài)良好的細胞有66株，占57.9%, 一般的細胞有43株，占37.7%；較差的細胞共有5株，占4.4%.

表1 MDCK單克隆細胞生長速度和狀態(tài)統(tǒng)計表

2.3 MDCK單克隆細胞形態(tài)分析

MDCK單克隆細胞共有3種細胞形態(tài)，第一類為典型的多角上皮樣細胞形態(tài)，與MDCK母細胞形態(tài)一致，長滿單層后呈規(guī)則石塊狀鋪展生長，貼壁迅速.高倍鏡下細胞胞質(zhì)豐滿，核仁清晰，如圖1A所示. 第二類為梭形成纖維狀細胞形態(tài)，與MDCK母細胞的形態(tài)差異較大，細胞呈梭形、長條形、不規(guī)則形，呈相互平行排列，細胞呈現(xiàn)成群放射狀、漩渦狀等形態(tài)，長滿匯合至100%時細胞呈細枝狀交錯生長，如圖1B所示.第三類為島狀樣細胞生長形態(tài)，與MDCK母細胞形態(tài)的差異更大.細胞單個貼壁，相互分散生長，一般不連成片、形成集落.相鄰單個細胞生長擁擠，細胞形成島狀樣生長，如圖1C所示.114株MDCK單克隆細胞的具體形態(tài)分布見表2，MDCK單克隆細胞中多角上皮樣細胞形態(tài)細胞有78株，占68%；成纖維樣細胞有13株，占12%；島狀樣細胞有23株，占20%.

表2 MDCK單克隆細胞形態(tài)表

A. 多角上皮樣細胞(×100)；B.梭形成纖維樣細胞(×100)；C.島狀樣細胞(×100)

3 討論

流感對人類健康威脅嚴重，及時接種疫苗是預(yù)防流感最有效的方法[7].目前，獲準生產(chǎn)人用流感疫苗的細胞系主要有 Vero細胞和MDCK細胞[8].近年來使用MDCK單克隆細胞生產(chǎn)流感疫苗獲得很大發(fā)展[9].有限稀釋法是制備MDCK單克隆細胞經(jīng)濟有效的方法，其通過細胞稀釋至每孔只有單個細胞后進行培養(yǎng)而獲得單克隆化細胞株，所制備的MDCK單克隆細胞株在生長特性上有較大差異.基于此，通過復(fù)蘇MDCK單克隆細胞株，統(tǒng)計所有細胞的生長速度、生長狀態(tài)以及細胞形態(tài)類型及其數(shù)量，確定制備的MDCK單克隆細胞庫的可用性.

MDCK細胞作為生產(chǎn)流感疫苗的基質(zhì)，其培養(yǎng)好壞直接影響著流感病毒的篩選[10].細胞生長好壞可通過細胞的活率、生長狀態(tài)、生長速度、生長形態(tài)來綜合評價，活率高、狀態(tài)好、速度快、形態(tài)均一的細胞更適用于科學(xué)研究.細胞復(fù)蘇后經(jīng)過培養(yǎng)可以修復(fù)損傷的細胞膜功能[11]，細胞活率在復(fù)蘇培養(yǎng)過程中可以得到顯著提高.本實驗室自建MDCK單克隆細胞庫細胞平均復(fù)蘇活率達0.954 ±0.016%，與細胞凍存前后活率差異不大，但比MDCK母細胞活率高.細胞的生長速度是提高實驗效率的重要條件，實驗周期是研究人員要密切關(guān)注的問題.生長速度的提高可以縮短實驗周期，篩選生長速度快的細胞就顯得尤為重要.MDCK單克隆細胞庫中大多數(shù)細胞均可在2～3 d長滿，有利于實驗快速有效地開展，縮短了實驗周期.細胞的生長狀態(tài)也是影響實驗成功與否的重要因素，生長狀態(tài)好的細胞更加有利于得到理想的實驗結(jié)果，MDCK單克隆細胞庫中生長狀態(tài)良好的細胞占比為57.9%，可為實驗提供可靠的細胞資源.細胞形態(tài)的多樣性可以用來評價MDCK單克隆細胞庫細胞的豐富性.本研究中MDCK單克隆細胞具有三種細胞形態(tài).

前期實驗自制的MDCK單克隆細胞庫內(nèi)細胞復(fù)蘇活率高，生長速度快，狀態(tài)良好，庫內(nèi)細胞有三種形態(tài)，可為后續(xù)甲型H1N1流感病毒篩選實驗提供敏感細胞基質(zhì)，為篩選提供豐富的資源，并為流感疫苗的生產(chǎn)參考依據(jù).