黃 濤

(天津市兒童醫(yī)院，天津 300134)

由于糖尿病腎病的病因病機(jī)還未搞清楚，因此西醫(yī)針對(duì)這一疾病的治療療效總是不夠理想，而中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)、多途徑和多層次的綜合治療優(yōu)勢(shì)，在臨床上多有用于糖尿病腎病方面的治療，療效肯定[1]。因此，為滿(mǎn)足臨床應(yīng)用需求，及時(shí)開(kāi)發(fā)針對(duì)糖尿病腎病治療的有效中藥新藥勢(shì)在必行。糖腎康膠囊處方是來(lái)源于老中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方，由丹參、黃連、知母、水蛭、黃芪和淫羊藿等藥材組成，臨床應(yīng)用時(shí)制備成湯劑，用于治療糖尿病腎病，應(yīng)用多年，療效可靠。為了掩蓋苦味、便于服用，考慮患者的順應(yīng)性，擬將其制成膠囊劑。其制備工藝為：黃連用乙醇單獨(dú)提取，淫羊藿等6味藥材采用水提醇沉工藝，分別制得干燥浸膏粉，混合后加輔料濕法制粒并裝0#膠囊。本研究采用薄層色譜法(TLC)進(jìn)行定性鑒別，分別鑒別了該制劑中的丹參、知母和黃芪；運(yùn)用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，選擇的指標(biāo)成分是處方中君藥淫羊藿的主要化學(xué)成分淫羊藿苷，以為建立糖腎康膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

DIONEX Ultimate型3000高效液相色譜儀(美國(guó)DIONEX公司)；AUY220型萬(wàn)分之一電子分析天平(日本Shimadzu公司)；AB135-S型十萬(wàn)分之一電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；BUG25-06型超聲波清洗儀(上海必能信超聲有限公司，功率：250 W，頻率：25 kHz)；Diamonsil C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬科技有限公司)；高效硅膠G板；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。菝葜皂苷元對(duì)照品(批號(hào)110744-200509，純度：95%)、丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)110532-201212，純度>98%)、黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)113791-200613，純度>98%)、淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào)113717-200415，純度>98%)、知母對(duì)照藥材(批號(hào)120170-200503)、丹參對(duì)照藥材(批號(hào)123823-201414)、黃芪對(duì)照藥材(批號(hào)113681-200613)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。實(shí)驗(yàn)所用藥材均購(gòu)自安國(guó)長(zhǎng)安中藥材有限公司，經(jīng)天津藥物研究院中藥現(xiàn)代研究部張鐵軍研究員鑒定，符合《中國(guó)藥典》2015年版一部要求。糖腎康膠囊(批號(hào)120803，120804，120805)為自制樣品。各藥味的陰性樣品均由除該藥味以外的其他藥味按原處方、工藝制備。

2 方法與結(jié)果

2.1定性鑒別

2.1.1丹參 稱(chēng)取經(jīng)研細(xì)的糖腎康膠囊內(nèi)容物1.0 g，加10 ml無(wú)水乙醇，加稀鹽酸調(diào)pH至2～3，超聲(功率：250 W，頻率：25 kHz)處理20 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取適量的丹酚酸B對(duì)照品，加甲醇溶解并定容，制備質(zhì)量濃度為1 mg/ml的丹酚酸B對(duì)照品溶液。另取丹參對(duì)照藥材過(guò)4號(hào)篩的細(xì)粉0.5 g，加25 ml甲醇，超聲處理10 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為對(duì)照藥材溶液。按處方工藝和比例制備缺丹參的陰性樣品，稱(chēng)取陰性樣品1.0 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》四部[2]TLC法試驗(yàn)，分別吸取以上4種溶液各10 μl，點(diǎn)到同一張硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲苯-甲醇-甲酸(3∶4∶2∶0.5∶2)為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，取出薄層板，于通風(fēng)櫥中晾干，噴以3%FeCl3乙醇溶液顯色，置日光燈下檢視。結(jié)果在與對(duì)照品和對(duì)照藥材薄層色譜的相應(yīng)位置上，各供試品色譜顯相同顏色的藍(lán)色斑點(diǎn)，陰性樣品色譜無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

1.陰性對(duì)照 2.對(duì)照品 3.對(duì)照藥材 4～6.供試品

2.1.2知母 稱(chēng)取經(jīng)研細(xì)的本品內(nèi)容物2.0 g，置于50 ml具塞錐形瓶中，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，過(guò)濾并蒸干濾液，殘?jiān)铀?0 ml使溶解，溶液中加鹽酸2 ml并搖勻；再加10 ml甲苯，水浴中加熱回流提取1 h，自然冷卻；分取甲苯層并蒸干，殘?jiān)尤燃淄? ml使溶解，作為供試品溶液。另取適量的菝葜皂苷元對(duì)照品，加三氯甲烷溶解并定容，制備質(zhì)量濃度為0.5 mg/ml的菝葜皂苷元對(duì)照品溶液。另取知母對(duì)照藥材細(xì)粉(過(guò)4號(hào)篩)1.0 g，按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。按處方工藝和比例制備缺知母的陰性樣品，稱(chēng)取陰性樣品2.0 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》四部[2]TLC法試驗(yàn)，分別吸取以上4種溶液各10 μl，點(diǎn)到同一張硅膠G薄層板上，以丙酮-環(huán)己烷-冰醋酸(1∶9∶0.2)為展開(kāi)劑進(jìn)行二次展開(kāi)，取出薄層板，于通風(fēng)櫥中晾干，噴顯色劑[8%香草醛無(wú)水乙醇-10%硫酸(1∶1)的混合溶液]，于105 ℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果在與對(duì)照品和對(duì)照藥材薄層色譜的相應(yīng)位置上，各供試品色譜顯相同顏色的黃色斑點(diǎn)，陰性樣品色譜無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

1.陰性對(duì)照 2.對(duì)照品 3.對(duì)照藥材 4～6.供試品

2.1.3黃芪 稱(chēng)取經(jīng)研細(xì)的本品內(nèi)容物3.5 g，加30 ml甲醇，冷浸過(guò)夜，超聲處理30 min，濾過(guò)，蒸干濾液，殘?jiān)?0 ml水并微熱溶解，用正丁醇(水飽和)振搖萃取2次(每次30 ml)，合并正丁醇液，用氨試液洗滌正丁醇液3次(每次20 ml)，棄去氨液，蒸干正丁醇液，殘?jiān)? ml水使溶解；經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂柱(12 cm×1.5 cm)，按步驟洗脫：50 ml水→30 ml 40%乙醇溶液→60 ml 70%乙醇溶液，收集70%乙醇溶液洗脫液并蒸干，殘?jiān)? ml甲醇溶解，作為供試品溶液[3，4]。另取適量的黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇溶解并定容，制備質(zhì)量濃度為1 mg/ml的黃芪甲苷對(duì)照品溶液。另取黃芪對(duì)照藥材細(xì)粉(過(guò)4號(hào)篩)3.0 g，按供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。按處方工藝和比例制備缺黃芪的陰性樣品，稱(chēng)取陰性樣品3.5 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按2015年版《中國(guó)藥典》四部[2]TLC法試驗(yàn)，分別吸取以上4種溶液各10 μl，點(diǎn)到同一張硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-氯仿-甲酸-水(20∶10∶11∶5)的下層溶液(混合液于10 ℃以下放置時(shí)分層)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材薄層色譜的相應(yīng)位置上，各供試品色譜顯相同顏色的棕褐色斑點(diǎn)，陰性樣品色譜無(wú)干擾。見(jiàn)圖3。

1.陰性對(duì)照 2.對(duì)照品 3.對(duì)照藥材 4～6.供試品

2.2含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(27∶73)；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μl。

2.2.2溶液的制備

2.2.2.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取適量的淫羊藿苷對(duì)照品，加甲醇溶解并定容，制成每1 ml含23.2 μg的溶液。

2.2.2.2供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定經(jīng)研細(xì)的本品內(nèi)容物0.3 g，置于50 ml具塞錐形瓶中，精密加入20 ml甲醇，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，自然冷卻，再次稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備 按處方工藝和比例制備缺淫羊藿的陰性樣品，精密稱(chēng)取陰性樣品0.3 g，并按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備淫羊藿陰性對(duì)照溶液。

2.2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖 4。由圖4可知，在該色譜條件下進(jìn)樣分析，淫羊藿苷與其他成分可達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度>1.5，理論塔板數(shù)不低于3 000。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

1.淫羊藿苷

2.2.4線(xiàn)性關(guān)系考查 精密吸取4、6、8、10、15和20 μl淫羊藿苷對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。以進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)、色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為Y=2 479X-2.553 1(r=0.999 9)。結(jié)果表明，淫羊藿苷進(jìn)樣量在0.093～0.464 μg之間具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.5精密度試驗(yàn) 取適量的淫羊藿苷對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6次，記錄色譜峰面積。結(jié)果，淫羊藿苷峰面積RSD為0.93%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取適量的上述供試品溶液(批號(hào)120803)，在室溫下放置0、4、8、10和12 h時(shí)，再按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。結(jié)果，淫羊藿苷峰面積RSD為1.47%(n=5)，表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取適量的同一批號(hào)樣品(批號(hào)120803)，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按上述色譜條件進(jìn)樣分析并計(jì)算含量。結(jié)果，淫羊藿苷的平均含量為1.403 1 mg/g，RSD為1.27%(n=6)，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.8加樣回收率試驗(yàn) 取適量的已知含量樣品(批號(hào)120803)，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的淫羊藿苷對(duì)照品，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均加樣回收率為99.18%,RSD為1.20%。見(jiàn)表1。

表1 淫羊藿苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2.9樣品中淫羊藿苷含量測(cè)定 每批取3份，分別按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積并計(jì)算樣品中淫羊霍苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論與討論

3.1定性鑒別 丹參、知母和黃芪為本方中主藥，因而對(duì)這3味藥進(jìn)行定性鑒別，在制定鑒別方法時(shí)，從供試品溶液制備方法的選擇、展開(kāi)劑組成及比例的選擇和拖尾控制等方面，參考了相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道及《中國(guó)藥典》方法，并進(jìn)行了考查和優(yōu)化，從而確定了最佳條件，方法簡(jiǎn)單可行。丹參薄層鑒別過(guò)程中，在處理方法選擇時(shí)，分別考查了熱回流和超聲處理兩種方法，最后選擇采用超聲處理的方法；在對(duì)丹參展開(kāi)劑考查時(shí)，發(fā)現(xiàn)使用石油醚-乙酸乙酯-二氯甲烷為展開(kāi)劑時(shí)陰性對(duì)照溶液有干擾斑點(diǎn)出現(xiàn)，故通過(guò)考查展開(kāi)劑組成和比例，最終確定以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲苯-甲醇-甲酸(3∶4∶2∶0.5∶2)為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)，結(jié)果分離效果良好且斑點(diǎn)清晰[5，6]。知母薄層鑒別過(guò)程中，參照文獻(xiàn)[7，8]制備供試品溶液和選擇展開(kāi)劑，對(duì)加入鹽酸的用量和時(shí)間進(jìn)行了考查，結(jié)果表明，在剛開(kāi)始直接加入鹽酸水解，發(fā)現(xiàn)濾液黏稠，不容易過(guò)濾，等提取液濾過(guò)后再加入鹽酸效果更好；分別加入鹽酸1、2和3 ml進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明2 ml的量就符合要求。黃芪薄層鑒別過(guò)程中，參照文獻(xiàn)[3]制備供試品溶液，對(duì)大孔吸附樹(shù)脂因素和氨水洗滌因素進(jìn)行了考查，最終確定利用氨試液洗滌，采用D101型大孔吸附樹(shù)脂柱，試驗(yàn)結(jié)果較滿(mǎn)意。

3.2含量測(cè)定 本研究采用高效液相色譜法，參考了2015年版《中國(guó)藥典》一部[9]和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10-12]，并進(jìn)行了考查和優(yōu)化，從而確定了最佳條件；提取溶劑考查時(shí)選擇了50%乙醇、50%甲醇和甲醇，結(jié)果表明甲醇的提取效果最好；研究中還對(duì)超聲提取時(shí)間進(jìn)行了考查，分別超聲提取20、30和40 min，結(jié)果表明提取30 min時(shí)樣品中的淫羊藿苷已提取完全，且雜質(zhì)較少。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于糖腎康膠囊的質(zhì)量控制。