劉 晴,李國玉*,呂鑫宇 ,朱丹丹, 張艷海,杜 倩,李 冉,呂春艷

[1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江省預(yù)防與治療老年性疾病藥物研究重點實驗室，黑龍江 150076； 2.賽默飛世爾科技(中國)有限公司,上海 201203]

根及根莖類藥材在中藥材中占比較大，如《中國藥典》2015版在上一版的基礎(chǔ)上新收載了3個中藥材品種，使收載中藥材總數(shù)達到了529種，根及根莖類藥材就占157種，并且增加了有些品種的顯微鑒別項目，以加強藥材的專屬性鑒別。類葉牡丹為小檗科紅毛七屬植物的根及根莖，又名紅毛七等，為東北地方藥材，味辛、苦，具有理氣止痛及祛風(fēng)活血功效，民間廣泛常用于風(fēng)濕骨病、胃腹疼痛及婦科疾病等的治療[1-3]。故本研究根據(jù)常見根及根莖類中藥材的顯微特征[4]，采用數(shù)碼技術(shù)通過數(shù)碼彩色圖片顯現(xiàn)類葉牡丹的顯微特征，相較于傳統(tǒng)的手描墨線圖模式能夠更加真實而直觀。借此為例展現(xiàn)中藥材的專屬性，以期為根及根莖類藥材的鑒別提供一定的參考。先前的研究[5]對類葉牡丹藥材中的6種皂苷類成分進行了一測多評，未富集總皂苷部位，但三萜皂苷是類葉牡丹中的一類重要活性成分，富集總皂苷成其有效部位，是該藥成藥性研究的重要內(nèi)容[6，7]，因此分別采用水飽和正丁醇萃取法、大孔樹脂柱色譜法對該藥的總皂苷進行富集，并以化合物leonticin D(1)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L- 吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1 → 4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6) -β-D-吡喃葡萄糖苷 (2)、Cauloside G(3)和Cauloside D(4)為對照品采用HPLC- ELSD法對多批次類葉牡丹總皂苷提取物進行了含量測定，對類葉牡丹總皂苷提取物為有效部位的成藥性研究提供了研究依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Motic 數(shù)碼顯微鏡 (中國，麥克奧迪公司，BA4000型)，鑷子，載、蓋玻片，刀片，酒精燈，扁藥匙，牙簽，濾紙。Waters 2695型高效液色譜儀(美國，沃特世公司)，Alltech 2000型ELSD檢測器(美國，Alltech公司)。

1.2試藥 水合氯醛及甘油(上海國藥集團)；色譜純甲醇及乙腈(美國Dikma公司)。AB-8大孔吸附樹脂(天津南開化工廠)，732陽離子交換樹脂(河北滄州河間水處理劑有限公司)；leonticin D(1)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L- 吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1 → 4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6) -β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、 Cauloside G(3)、 Cauloside D(4)對照品均為自制(純度98%以上)；人參、黃芪、甘草、大黃的粉末(過80～100目篩)，均由哈爾濱商業(yè)大學(xué)中藥教研室購自哈藥集團世一堂制藥廠(批號分別為20170917,20180812,20180834,20180422)，類葉牡丹分別購自黑龍江、河北、安徽、湖北。上述藥材經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)曲中原教授鑒定為人參(PanaxginsengC A Mey )、黃芪[Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge]、甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)、大黃(RheumpalmatumL)和類葉牡丹(CaulophyllumrobustumMaxim),樣品標本保存于哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院。

2 方法與結(jié)果

2.1顯微鑒別

2.1.1徒手切片法[8]在室溫下，對類葉牡丹根及根莖分別進行徒手切片后觀察分析。粉末顯微采用水合氯醛透化法[9]，進行多次透化，直至達到透化觀察要求。上述切片或透化粉末根據(jù)選取目標物的不同，切換Motic電子顯微鏡的目鏡倍數(shù)，一般10×10 倍鏡目標視野較好， 10×40倍鏡以上有利于特征目標物的觀察和測量，進而通過數(shù)碼顯微鏡拍攝系統(tǒng)拍錄目標物的顯微鑒別特征。

2.1.2黃芪、甘草、黃連、大黃為例的粉末顯微特征 黃芪、甘草、黃連、大黃均為藥用部位為根或根莖或二者兼用的代表性中藥，其粉末顯微特征在鑒別根及根莖類中藥時也具有代表性，比如黃連粉末顯微特征中的鱗葉表皮細胞，石細胞、黃芪中的分叉纖維；甘草粉末顯微特征中的晶鞘纖維；大黃中的草酸鈣大簇晶、導(dǎo)管等。見圖1。

2.1.3基于根及根莖類藥材顯微特征的類葉牡丹顯微特征 類葉牡丹藥用部位為根及根莖，其除具有一般根及根莖類藥材的顯微特征外，該藥材因外在性狀特征及生長環(huán)境，所以顯微特征及后含物具有自身的特點。

a.黃芪的分叉纖維b.甘草晶鞘纖維 c.大黃草酸鈣簇晶d.大黃螺紋導(dǎo)管 e.黃連鱗葉表皮細胞 f.黃連石細胞

2.1.3.1類葉牡丹根及根莖的橫切面的顯微特征 根及根莖呈圓柱形或類圓柱形，外表棕褐或棕黃色，部分表皮有木栓化，有時可見脫落的棕黃色栓皮，皮層較寬，韌皮部較窄，多為薄壁細胞組成，根中心木纖維集中，根及根莖中心有髓壁細胞，易形成髓。見圖2。

1.木栓層 2.皮層 3.韌皮部 4.木質(zhì)部 5.髓薄壁細胞

2.1.3.2類葉牡丹根及根莖粉末的顯微特征 根及根莖均為黃白色粉末，表皮細胞多呈方形或類方形，根表皮細胞有的呈圓形，表皮木栓化細胞棕褐色，壁增厚，多呈方形，纖維導(dǎo)管多見，少見晶鞘纖維，石細胞方形或類圓形，少見丁字形石細胞。見圖3。

1.表皮細胞 2.木栓細胞 3.纖維 4.晶鞘纖維 5.導(dǎo)管 6.石細胞

2.2含量測定

2.2.1溶液的制備

2.2.1.1對照品溶液的制備 先精確稱取對照品leonticin D(1)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L- 吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1 → 4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)和Cauloside D(4)分別為3.19、3.49及3.20 mg，并置5 ml量瓶中,甲醇定容，搖勻, 過0.45 μm濾膜；再精確稱量對照品Cauloside G (3)3.30 mg置10 ml量瓶中,依上法定容，過濾制成對照品溶液。

2.2.1.2供試品溶液的制備 稱取類葉牡丹的根及根莖粗粉,分別用6 BV及4 BV 70%乙醇水回流提取,每次2 h,合并濾液,回收至干得類葉牡丹提取物。①類葉牡丹提取物蒸餾水溶解，用水飽和的正丁醇萃取3次,回收正丁醇,得正丁醇總皂苷部位；②類葉牡丹提取物水懸浮經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂依次用蒸餾水、70%乙醇洗脫，70%乙醇洗脫組分經(jīng)減壓回收得大孔樹脂總皂苷部位。取適量2種總皂苷樣品，用甲醇稀釋，過0.45 μm微孔濾膜，進樣，使其峰面積在標準曲線范圍內(nèi)，供含量測定用。

2.2.2色譜條件及方法 色譜柱：Kromasil ODS (250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相為甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫：0～10 min，60%～63% A；10～20 min，63% A；20～25 min，63%～100%A；25～30 min，100% A；體積流量：1.0 ml/min; 柱溫30 ℃；ELSD檢測器條件：漂移管溫度90 ℃；氣體流速 2.1 ml/min; 數(shù)據(jù)采集頻率10 Hz；進樣量10 μl。對照品及供試品液相色譜圖見圖4。

1.leonticin D2. 3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L- 吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1 → 4)-β-D -吡喃葡萄糖-(1→6) -β-D-吡喃葡萄糖苷 3. cauloside G 4. cauloside D

2.2.3線性關(guān)系考查 精密稱量“2.2.1.1”項下的對照品1、2、4溶液，分別進樣2、4、6、8和10 μl，取對照品3溶液，分進樣別5、10、15、20和25 μl，按上述色譜條件，以對照品質(zhì)量濃度的自然對數(shù)為橫坐標(X)，以吸收峰面積的自然對數(shù)為縱坐標(Y)繪制標準曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，并測定分析方法的檢測限(LOD)。見表1。

表1 類葉牡丹皂苷對照品1～4的線性方程及相關(guān)數(shù)據(jù)

2.2.4精密度試驗 分別取對照品溶液按“2.2.2”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄化合物leonticin D(1)、 3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L- 吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1 → 4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6) -β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、Cauloside G(3)和Cauloside D(4)峰面積，計算峰面積的RSD分別為0.74%、0.86%、0.98%和1.02%，均小于2%, 符合要求。

2.2.5穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液在室溫下，分別于0、3、6、9和12 h按“2.2.2”項下色譜條件分別進樣5次，記錄化合物1、2、3和4的峰面積，其峰面積的RSD分別為1.48%、1.94%、0.33%和1.34%，均小于2%, 符合要求。

2.2.6重復(fù)性試驗 精密稱量供試品溶液共6份，按“2.2.2”項下色譜條件分別進樣，記錄化合物1、2、3和4的峰面積，其峰面積的RSD分別為1.41%、0.89%、2.65%和1.83%，均小于3%, 符合要求。

2.2.7加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的類葉牡丹供試品粉末6份，按照供試品所含對照品1∶1比例加入相應(yīng)對照品，并制備成供試品溶液，測定化合物1、2、3和4的含量，結(jié)果化合物1、2、3和4的平均回收率分別為99.63%、98.52%、99.41%和98.15%，RSD分別為1.80%、1.47%、1.40%和1.02%，表明準確性良好，方法可行。 見表2。

2.2.8樣品含量測定 精密稱定“2.2.1.2”項下制得類葉牡丹正丁醇浸膏粉末84.5 mg, 定至25 ml量瓶中，充分溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣10 μl，平行進樣3次，記錄與對照峰保留時間一致峰的面積，通過標準曲線計算含量。不同產(chǎn)地類葉牡丹正丁醇部位及AB-8大孔吸附樹脂部位總皂苷中各化合物百分含量結(jié)果見表3。

表2 類葉牡丹4種皂苷的回收率測定結(jié)果(n=9)

表3 樣品百分含量測定結(jié)果

3 討論

3.1根及根莖類藥材，特別是根莖部分，大多纖維性較強，因其本質(zhì)為莖，所以橫切面顯微觀察到髓，類葉牡丹根的顯微特征因其顏色特征，在顯微特征中可觀察到棕褐色的木栓細胞。植物的細胞后含物是其對生長環(huán)境的應(yīng)激，比如在粉末中觀察到的晶纖維及丁字形石細胞猜測與植物對環(huán)境的應(yīng)激有關(guān)，與以往的報道相比，首次在該植物中觀察到晶纖維。

3.2在精制富集總皂苷時，本文選用的兩種方法都是常用的經(jīng)典方法，但由于類葉牡丹中含有大量的五環(huán)三萜雙糖鏈皂苷[10]，因此極性較大，特別是在AB-8大孔吸附樹脂為弱極性樹脂，因此在柱色譜洗脫時，在水洗脫時注意控制水的用量，以免大極性皂苷隨水洗脫出來。

3.3 關(guān)于對照品的選擇，在研究中發(fā)現(xiàn)類葉牡丹中的五環(huán)三萜雙糖鏈皂苷極性相近，有很多同分異構(gòu)體，原有色譜條件下分離度不夠理想，因此在已有研究的基礎(chǔ)上，通過調(diào)整色譜條件中的流動相實現(xiàn)了良好的分離，另外這4種對照化合物含量較高，其三萜皂苷母核葳嚴仙皂苷元和常春藤皂苷元是類葉牡丹中三萜皂苷的兩種主要代表性皂苷元也是選擇的另一原因。