稅鳳春，華曉東，徐 琳，芮 菁

(天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070)

近年來(lái)，在血小板功能評(píng)價(jià)中，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板活化生物標(biāo)志物-膜糖蛋白的方法成為主流，與血小板聚集率檢測(cè)等傳統(tǒng)方法相比，該方法具有操作易規(guī)范化、過(guò)程簡(jiǎn)單、無(wú)需制備富血小板血漿、快速準(zhǔn)確、更易量化等優(yōu)點(diǎn)。但由于血小板在體外非?；钴S，影響因素較多，如采血環(huán)節(jié)、抗凝劑使用不當(dāng)?shù)纫自斐勺园l(fā)活化率升高，然而目前國(guó)內(nèi)有關(guān)血小板活化生物標(biāo)志物檢測(cè)影響因素研究報(bào)道少見(jiàn)。本文研究了不同抗凝劑對(duì)其影響作用，以期確定一個(gè)較好的標(biāo)本抗凝方法。

1 材料與儀器

1.1受試物 五水枸櫞酸鈉(Na3C6H5O7·5H2O)，天津市贏(yíng)達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠(chǎng)，臨用前用純化水配制成3.8%濃度的溶液備用。EDTAK2采血管，批號(hào) 20160502，規(guī)格 0.5 ml，山東省成武縣華博醫(yī)療器械有限公司；肝素鈉采血管，批號(hào) 20170112，規(guī)格 1 ml，蘇州靈巖醫(yī)療器械有限公司；3.2%枸櫞酸鈉采血管(1∶9)，批號(hào) 20170324，規(guī)格 1 ml，蘇州靈巖醫(yī)療器械有限公司。

1.2試劑 Anti-Mouse/Rat CD62p PE/Cy7(P-selectin)，批號(hào) B223759； Anti-Mouse/Rat CD61 PE，批號(hào) B216420，均購(gòu)自Biolegend。Rat IgG2a-PE/Cy7，批號(hào) 4290714；Rat IgG-PE，批號(hào) 4281135，均購(gòu)自eBioscience。ADP，批號(hào) SLBP6247V，SIGMA。 鞘液(Focusing Fluid)，批號(hào) 0316C225，Life Technologies Corporation。4%多聚甲醛，批號(hào) 6119851，Biolegend公司。多聚甲醛，批號(hào) SZBG1160V，SIGMA。稀釋液(Flow Cytometry Staining Buffer)，批號(hào) 6111151，聯(lián)科生物。補(bǔ)償微球(UltraComp eBeads)，批號(hào) 4312694，ThermoFisher。PBS (pH 7.2-7.4)，批號(hào) 16052302，無(wú)錫傲銳東源生物科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，SPF級(jí)，體重 200～300 g，雌雄兼用，雌鼠無(wú)孕。北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)進(jìn)，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0001。在實(shí)驗(yàn)期間按國(guó)家對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件要求進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.4儀器 流式細(xì)胞儀Attune NxT，ThermoFisher SCIENTIFIC；XS-205DU電子天平，精度0.1 mg，試劑稱(chēng)量用；XP2001S電子天平，精度 1 g，動(dòng)物稱(chēng)量用； 5 ml、1 ml、200 μl、1～10 μl移液器及相應(yīng)規(guī)格吸頭；37 ℃恒溫水浴、具塞小瓶、5 ml塑料流式管、1.5 ml EP管、玻璃毛細(xì)采血管、計(jì)時(shí)器、試管架等。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 試驗(yàn)方法

3.1流式細(xì)胞檢測(cè)方法 每只動(dòng)物取抗凝血50 μl，測(cè)定血小板自發(fā)活化率；另取抗凝血50 μl，加入50 μl終濃度為10 μmol/L的ADP激活，再分別加入抗體CD62p PE/Cy7和CD61 PE各1.0 μl雙標(biāo)，以CD61標(biāo)記所有血小板，以CD62p標(biāo)記活化血小板。在4 ℃暗處孵育20 min后，各管加入0.5 ml 4%多聚甲醛PBS于4 ℃暗處固定10 min。分別取固定后的血樣50 μl，加入1 ml稀釋液稀釋后上機(jī)分析，檢測(cè)經(jīng)ADP激活的血小板活化率。在CD61 PE/側(cè)向角光散射(SSC)雙參數(shù)散點(diǎn)圖中劃定血小板細(xì)胞群，計(jì)數(shù)5 000個(gè)血小板，進(jìn)一步在CD61/CD62p散點(diǎn)圖中計(jì)數(shù)CD61及CD62p陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)，并以CD62p陽(yáng)性表達(dá)率占CD61表達(dá)率的百分比反映血小板的活化率。

3.2不同抗凝劑對(duì)ADP激活血小板膜糖蛋白CD62p影響的比較 取SD大鼠18只，雌雄各半，250～300 g，分成枸櫞酸鈉組、肝素鈉組和EDTAK2組，每組各6只，眼眶取血，置于不同抗凝采血管中制備抗凝血，按“3.1”項(xiàng)下方法檢測(cè)CD62p表達(dá)率。

3.3不同濃度枸櫞酸鈉抗凝劑對(duì)ADP激活血小板膜糖蛋白CD62p影響的比較 取SD大鼠12只，雌雄各半，250～300 g，分成2組，3.2%枸櫞酸鈉抗凝組和自配3.8%枸櫞酸鈉抗凝組，每組6只，眼眶取血，置于不同抗凝采血管中制備抗凝血，按“3.1”項(xiàng)下方法檢測(cè)CD62p表達(dá)率。

4 結(jié)果

4.1不同抗凝劑對(duì)ADP激活CD62p表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同ADP激活條件下，EDTAK2管抗凝標(biāo)本所測(cè)的CD62p表達(dá)率最低，枸櫞酸鈉抗凝稍高，肝素鈉抗凝活化百分率最高。肝素鈉抗凝能明顯促進(jìn)ADP激活CD62p的表達(dá)，同時(shí)使未用ADP處理過(guò)的樣本CD62p的自發(fā)表達(dá)率明顯高于文獻(xiàn)報(bào)道的2%的基礎(chǔ)值[1]；EDTAK2管標(biāo)本在A(yíng)DP激活后CD62p表達(dá)無(wú)明顯的升高，與枸櫞酸鈉、肝素鈉組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同抗凝劑對(duì)血小板活化的影響

4.2不同濃度枸櫞酸鈉抗凝對(duì)ADP激活CD62p表達(dá)的影響 在相同ADP激活條件下，采用3.2%枸櫞酸鈉抗凝和采用自配的3.8%枸櫞酸鈉抗凝，CD62p表達(dá)率無(wú)明顯差異。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同濃度枸櫞酸鈉抗凝劑對(duì)血小板活化的影響

5 討論

檢測(cè)血小板功能的方法有多種，但常有爭(zhēng)議，主要是由于影響因素較多造成結(jié)果的不穩(wěn)定引起，如血樣的收集、抗凝劑的選擇、標(biāo)本處理等因素，都可能導(dǎo)致體外血小板活化而影響結(jié)果的判定，最終影響其在科研、標(biāo)準(zhǔn)制定及臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。全血法流式細(xì)胞術(shù)可用于血小板功能的檢測(cè)，其是一種在分子水平通過(guò)觀(guān)察活化標(biāo)志物CD62p的表達(dá)來(lái)分析血小板活化的新方法，有許多優(yōu)點(diǎn)[2]：需血量少，靈敏度高，特異性好，避免了體外血小板激活和丟失，不需要分離血小板，因而減少了制備過(guò)程中人為活化的干擾因素等。因此，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板膜糖蛋白分子表達(dá)水平越來(lái)越多地應(yīng)用在臨床診斷乃至藥物活性評(píng)估中。CD62p又稱(chēng)血小板活化依賴(lài)α顆粒膜蛋白，血小板表面CD62p的表達(dá)能夠準(zhǔn)確反映血小板活化程度[3,4]。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板表面CD62p的表達(dá)是目前文獻(xiàn)報(bào)道最多的血小板活化生物標(biāo)志物檢測(cè)方法[5]。其特異性得到廣泛認(rèn)可，在臨床診斷、藥物活性評(píng)價(jià)等環(huán)節(jié)中應(yīng)用前景廣泛，因此更需要排除各種影響因素的干擾，以獲得穩(wěn)定可靠的測(cè)定結(jié)果。

現(xiàn)代臨床研究證明，中醫(yī)血瘀證患者存在血小板活化現(xiàn)象[6]。血小板活化生物標(biāo)志物CD62p的特異性良好，非常適用于活血化瘀藥物的活性評(píng)價(jià)，并可將其引入藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。由于活血化瘀藥物是抑制血小板活化，因此必須在給藥的同時(shí)加入激動(dòng)劑ADP，以此獲得CD62p的高表達(dá)，在此基礎(chǔ)上評(píng)估藥物的活性，所有的檢測(cè)操作環(huán)節(jié)都不能對(duì)其造成不良影響。為了加強(qiáng)血小板活性測(cè)定方法的質(zhì)量控制，本文研究了不同抗凝劑對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD62p表達(dá)的影響。

血小板活化的最主要表現(xiàn)是黏附與聚集，為防止血樣采集階段出現(xiàn)凝血現(xiàn)象對(duì)后續(xù)檢測(cè)造成影響，需選擇合適的抗凝劑進(jìn)行抗凝。枸櫞酸鈉(檸檬酸鈉)與血液中的鈣離子形成可溶性的螯合物，使Ca2+失去凝血作用，阻止血液凝固；肝素鈉通過(guò)與抗凝血酶結(jié)合，增強(qiáng)抗凝血酶的作用，滅活絲氨酸蛋白酶，阻止凝血酶的形成和血小板聚集，從而阻止血液凝固；EDTAK2與血液中的鈣離子結(jié)合形成配位化合物，阻止血凝。

血小板聚集是判斷血小板功能的金標(biāo)準(zhǔn)，在先天性和獲得性血小板疾病診斷中很有價(jià)值[7]，而Ca2+是血小板聚集所必需。本研究結(jié)果顯示：肝素鈉抗凝使自發(fā)活化率明顯高于文獻(xiàn)報(bào)道的2%的基礎(chǔ)值，而自發(fā)活化率升高對(duì)ADP激活率有影響。EDTAK2抗凝因鈣被絡(luò)合過(guò)多而致血小板不聚，ADP激活率明顯低于肝素鈉與枸櫞酸鈉組。因此肝素鈉和EDTAK2絕對(duì)不能作為流式細(xì)胞術(shù)測(cè)CD62p的抗凝劑。

綜上所述，不同抗凝劑對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板膜糖蛋白表達(dá)均有不同程度的影響，枸櫞酸鈉是流式細(xì)胞術(shù)測(cè)血小板膜糖蛋白的最佳抗凝劑。