周俊

【摘 要】

目的：探討莪術揮發(fā)油對人宮頸癌裸鼠移植瘤血管生成VEGF通路的可能作用機制。方法： 對處死裸鼠剝取腫瘤標本檢測瘤重、瘤體積，計算抑瘤率；采用免疫組織化學技術檢測VEGFR-2、VEGF-C的蛋白表達。結果：莪術油高、中劑量組VEGF-C的表達較模型組顯著降低； 莪術油高、中、低劑量組VEGFR-2的表達較模型組降低。 結論：莪術油對人宮頸癌hela細胞裸鼠移植瘤的血管生成有明顯的抑制作用。

【關鍵詞】莪術油；hela細胞；血管生成；裸鼠；VEGF

【中圖分類號】 R197.3

【文獻標識碼】 A

【文章編號】 1672-3783（2019）02-03-063-01

腫瘤是一種超過正常限度生長的組織，而其新生血管的形成對腫瘤的生長和轉移具有重要意義。血管生成是指活體組織在已經存在的微血管床上芽生出新的以毛細血管為主的血管系統(tǒng)的過程。有別于胚胎時期由早期內皮細胞分化形成新血管的過程即血管形成（vasculogenesis）[1]。腫瘤血管生長可分為前血管期（avascular phase）和血管期（vascular phase）。在前血管期，腫瘤細胞主要依靠彌散供養(yǎng)以及排泄廢物。這個時期腫瘤細胞增殖迅速，但是增殖與凋亡處于動態(tài)平衡，腫瘤直徑不超過1～2mm，可保持數月或數年不發(fā)生轉移。當腫瘤組織直徑大于1cm后，被激活的腫瘤組織通過“自分泌”或“旁分泌”機制合成和分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial cell growth factor， VEGF），促進腫瘤周圍組織建立起豐富的毛細血管網，有利于腫瘤細胞在新的部位生長及增殖[2]，這就是血管期。本研究通過人宮頸癌裸鼠移植瘤模型治療實驗，評價莪術油有效提取物治療人宮頸癌的有效性，初步探討莪術油有效提取物的動物體內抗宮頸癌的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞株、動物及藥物：人宮頸癌Hela細胞株，購自武漢大學保藏中心。Balb/c-nu品系裸鼠，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。飼養(yǎng)于貴陽醫(yī)學院動物中心SPF級動物實驗室獨立籠盒飼養(yǎng)系統(tǒng)。溫莪術藥材購于四川雙流縣溫郁金基地，經鑒定為姜科植物溫郁金（Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling）的干燥根莖。采取壓榨粗油經水蒸汽精制法制備莪術揮發(fā)油。陽性藥物5-Fu（5-氟尿嘧啶），購于天津金耀氨基酸有限公司。VEGF-C兔抗人多克隆抗體、VEGFR-2兔抗人多克隆抗體、PV9000二步法試劑盒，購于北京中杉金橋。

1.2 實驗方法

1.2.1 人宮頸癌裸鼠移植瘤模型的建立

于裸鼠右側腋部外上方皮膚注射hela細胞懸液，7d后接種Hela細胞的裸鼠均出現(xiàn)直徑大約5mm的皮下結節(jié)，移植瘤模型建立。接種后將已建立皮下移植瘤模型的裸鼠隨機分為莪術油低劑量組（8mg/kg）、莪術油中劑量組（16mg/kg）、莪術油高劑量組（32mg/kg）、模型組、5-Fu組（20mg/kg），加上正常對照組，共計6個實驗組。腹腔注射給藥給藥，共給藥10次，持續(xù)20天。

1.2.2 觀察指標

1.2.2.1 移植瘤重量及體積

抑瘤率（%）=（1-治療組平均瘤重/模型組平均瘤重）×100%。根據V=ab2/2（單位mm3）公式計算腫瘤體積，繪制瘤體生長曲線。

1.2.2.2 免疫組化法的檢測

取腫瘤組織標本，采用PV二步法免疫組化技術，按照北京中杉金橋試劑盒說明書進行操作。VEGF-C、VEGFR-2的陽性表達均定位于宮頸癌細胞的胞漿，并呈棕黃色顆粒，根據平均透光度進行測評。

1.3 數據統(tǒng)計

采用SPSS17.0軟件系統(tǒng)對相關數據資料進行分析，計量資料用x±s表示，各組間兩兩比較采用獨立樣本T檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05時認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 瘤重、瘤體積檢測

莪術油高、中、低劑量組瘤重與模型組比較明顯減輕，差異具有統(tǒng)計學意義；高、中劑量組瘤體積與模型組比較顯著縮小，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2 免疫組化染色結果

2.2.1 VEGF-C的表達結果

各組裸鼠腫瘤組織VEGF-C的表達，顯微鏡下可見，腫瘤細胞胞漿中呈棕黃色改變即為陽性改變。平均透光度測量值與免疫組化標記表達程度呈反比關系，莪術油高、中、低劑量組VEGF-C平均透光度的結果與模型組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.2.2 VEGFR-2的表達結果

各組裸鼠腫瘤組織VEGFR-2的表達，顯微鏡下可見，腫瘤細胞胞漿中呈棕黃色改變即為陽性改變。平均透光度測量值與免疫組化標記表達程度呈反比關系，莪術油高、中劑量組VEGFR-2平均透光度的結果與模型組比較顯著降低，莪術油低劑量組VEGFR-2平均透光度的結果與模型組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01，P<0.05）。

3 討論

血管生成（angiogenesis）是近年來興起的一個新的醫(yī)學研究領域，腫瘤的生長浸潤依賴于腫瘤內新生血管的形成，這一觀點被認為是腫瘤研究領域中一個新的里程碑。目前發(fā)現(xiàn)的VEGF受體有5種：血管內皮生長因子受體-1（VEGFR1，F(xiàn)lt-1）、血管內皮生長因子受體-2（VEGFR2，KDR）、血管內皮生長因子受體-3（VEGFR3）、神經纖毛蛋白-1受體（NP-l）、神經纖毛蛋白2受體（NP-2）[3-4]。研究證實， VEGFR-2在VEGF的信號轉導及血管內皮生成中起主導作用。 因此， VEGFR-2成為當前抗腫瘤血管生成研究中的熱點。宮頸癌復發(fā)患者的VEGFR-2表達水平明顯高于原發(fā)者，另外還有人提出，VEGF/VEGFR-2途徑通過新生血管的形成增加腫瘤的轉移的結論[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中有VEGF-C 及其受體VEGFR-2（KDR） 的表達，但VEGFR-3 主要在間質淋巴管表達。因此提出，VEGF-C作用于腫瘤細胞上的VEGFR-2（KDR） ，可能直接影響腫瘤細胞的生物學行為[6]。

研究結果顯示在體外荷瘤裸鼠移植瘤中莪術油高、中、低劑量組VEGF-C平均透光度的結果與模型組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義。VEGFR-2平均透光度的結果與模型組比較均有降低，差異具有統(tǒng)計學意義。兩者研究結果在抗腫瘤血管生成方面呈正相關性。表明莪術油可能通過下調VEGF這條信號通路，達到抗腫瘤血管生成的目的。莪術油能抑制人宮頸癌Hela細胞裸鼠移植瘤的生長，其可能作用機制與下調血管內皮生長因子VEGF-C和VEGFR-2蛋白的表達有關， 血管生成是腫瘤生長轉移過程中的關鍵步驟，血管生成因子又在其中起了重要作用。抗血管生成治療作為抗腫瘤治療的新方法具有廣闊應用前景。

參考文獻

[1] 陳錫強，侯海榮，劉可春等.天然產物抗血管生成的研究進展[J].山東科學，2010，23（6）：34-38.

[2] 萬 博， 劉 煜.作用于VEGF信號通路的血管生成抑制劑[J].綜述與專論，2010，34（6）：256-263.

[3] 趙淑萍，王澤華.宮頸癌中VEGF—C及其受體mRNA的表達及其臨床意義[J].中國癌癥雜志，2006，16（4）：290-294.

[4] 杜雪，糜若然.VEGF-C 對宮頸癌細胞增殖和凋亡信號傳導通路的影響[J].現(xiàn)代婦產科進展，2011，20（11）：877-855.

[5] 陳星，王美芬，吳朝陽等.siRNA 沉默VEGF-C基因對宮頸癌HeLa 細胞的生物學特性影響[J].醫(yī)學研究雜志，2011，40（11）：58-63.

[6] 高經緯，黃劍飛.VEGFR-2（KDR）抗體與婦科惡性腫瘤[J].南通大學學報，2013，33（2）：123-125.