趙越，孫媛媛，佟雪，岳鵬杰，富偉能

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室，沈陽 110122）

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，以鱗狀細胞癌為主［1］。雖然治療手段不斷進步，但是喉癌患者的總生存率仍未提高［2］，侵襲轉(zhuǎn)移是喉癌的主要死因［3］。因此，研究喉癌發(fā)生發(fā)展的分子機制有助于發(fā)現(xiàn)喉癌診治和預(yù)后判定的分子標(biāo)志物，具有重要的潛在臨床意義。微小RNA （microRNA，miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因其在人體多種體液中穩(wěn)定表達可望成為多種疾病的分子標(biāo)志物［4］。前期工作［5］表明，miR-362-3p是MYCT1基因的下游調(diào)控基因。miR-362-3p在腎細胞癌［6］、乳腺癌［7］、血管平滑肌細胞［8］、滋養(yǎng)層細胞［9］和胃癌細胞［10］的遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。然而，miR-362-3p在喉癌中的作用和機制研究未見報道。本研究擬通過分子生物學(xué)技術(shù)檢測miR-362-3p在喉癌組織中表達水平及其對喉癌細胞遷移能力的影響，為進一步研究miR-362-3p在喉癌中的作用和分子機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本收集：50例喉癌及癌旁正常組織標(biāo)本取自解放軍第463醫(yī)院耳鼻喉科，手術(shù)后立即置于-80℃深凍冰箱中保存?zhèn)溆?，其中?2例標(biāo)本具有完整臨床資料信息，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，本項目研究經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 細胞株：人喉癌Hep-2細胞購自中科院上海細胞所。

1.1.3 試劑：Trizol試劑、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司， Poly plus轉(zhuǎn)染試劑購自法國Afao公司，8.0 μ m 孔徑 Transwell 小室購自美國Coster公司。

1.2 方法

1.2.1 實時PCR檢測：應(yīng)用Trizol試劑提取細胞和組織總RNA，應(yīng)用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)miRNA為cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min。以U6作為內(nèi)參，應(yīng)用實時PCR檢測miR-362-3p表達水平。miR-362-3p模擬物、抑制劑和陰性對照microRNA由武漢金開瑞生物工程公司合成，主要引物序列：U6，F(xiàn)，5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’； R，5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。 miR-362-3p，5’-AACACACCTATTCAAGATTCA-3’。通用下游引物，5’- CGAATTCTAGAGCTCGAGGCAGGCGACAT GGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATC CACTAGTCC （T） 25VN-3。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染：喉癌Hep-2細胞以2.5×105/孔密度種于6孔板中，培養(yǎng)過夜至細胞匯合度約為70%。根據(jù)Poly plus轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，將miR-362-3p模擬物、抑制劑和陰性對照microRNA轉(zhuǎn)染Hep-2細胞，4～6 h后更換培養(yǎng)基。48 h后提取細胞RNA，應(yīng)用實時 PCR檢測miR-362-3p表達水平。

1.2.3 細胞劃痕愈合實驗：應(yīng)用200 μ L槍頭在轉(zhuǎn)染后的6孔板各孔直徑處劃過，顯微鏡下觀察并拍照。繼續(xù)培養(yǎng)細胞，分別在24 h、48 h顯微鏡下測量遷移距離并拍照，統(tǒng)計分析細胞遷移距離。

1.2.4 Transwell遷移小室實驗：0.25%胰酶消化轉(zhuǎn)染后的細胞，收集細胞沉淀并用雙無培養(yǎng)基重懸細胞。在上層小室中加入2×104個細胞，下室加入600 μ L正常培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，依次用4%多聚甲醛固定，蘇木素染色1 min、伊紅染色2 min、蘇木素復(fù)染1 min，用刀片切下膜，中性樹膠封片。顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)細胞并拍照，5個視野平均數(shù)作為每個小室的細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-362-3p在喉癌中表達水平的檢測結(jié)果

以U6為對照，應(yīng)用實時PCR檢測50例喉癌和癌旁正常組織中miR-362-3p表達水平，結(jié)果表明，66%（33/50） 喉癌組織中miR-362-3p表達水平 （8.84±21.42）較癌旁正常組織 （1.76±3.03）升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （t = 2.316，P = 0.025）。

2.2 miR-362-3p在喉癌組織中表達水平與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果表明，miR-362-3p與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和喉癌臨床分期密切相關(guān) （均P < 0.05），而與患者性別、年齡、分化等因素不相關(guān) （均P > 0.05），見表1。

2.3 miR-362-3p對喉癌Hep-2細胞遷移能力的影響

表1 miR-362-3p的表達水平與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between miR-362-3p expression and clinicopathological parameters of laryngeal cancer patients

實時 PCR結(jié)果顯示，miR-362-3p模擬物組 （73.33±48.39） 和抑制物組 （0.38±0.11） 與陰性對照microRNA組 （NC組，1.00±0.00） 比較，喉癌Hep-2細胞中miR-362-3p表達水平分別顯著升高和降低 （均P < 0.05），提示轉(zhuǎn)染成功。劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，miR-362-3p模擬物組細胞遷移距離顯著大于NC組，而miR-362-3p抑制劑組遷移距離顯著小于NC組 （均P < 0.05），見表2、圖1A；Transwell實驗結(jié)果顯示，miR-362-3p 模擬物組遷移細胞數(shù)量顯著高于NC組，而miR-362-3p 抑制劑組遷移細胞數(shù)目顯著少于NC組 （均P < 0.05），見表2、圖1B。

表2 各組Hep-2細胞遷移距離和遷移細胞數(shù)比較Tab.2 Analysis of Hep-2 cell migration distance and numbers according to transfection

圖1 miR-362-3p對喉癌細胞遷移能力的影響Fig.1 Effects of miR-362-3p on Hep-2 cell migration

3 討論

miR-362是重要微小非編碼RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miR-362在不同腫瘤中作用不同，提示其具有組織特異性。miR-362-3p在腎癌和乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用［6-7］，而在胃癌和肝癌中發(fā)揮癌基因作用［10-12］。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-362-3p在喉癌組織中高表達，臨床病理特征分析結(jié)果顯示miR-362-3p在喉癌組織中的表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)。同時，miR-362-3p促進喉癌細胞遷移，提示其在喉癌中發(fā)揮潛在癌基因作用。與本研究結(jié)果相似，以往研究［10-13］表明miR-362-3p在胃癌、肝癌和結(jié)腸癌中高表達，促進胃癌細胞的遷移。而與本研究結(jié)果相反，以往研究［6-7］表明，miR-362-3p在腎癌和乳腺癌中低表達并抑制腎癌和乳腺癌細胞的遷移。除腫瘤外，低氧條件下miR-362-3p抑制滋養(yǎng)層細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［9］；miR-362-3p在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者血液中低表達，并抑制血管平滑肌細胞遷移［8］。

眾所周知，miRNA通過抑制或降解靶基因mRNA發(fā)揮生物學(xué)功能。miR-362-3p通過靶向CD82促進胃癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［10］。在腎細胞癌中miR-362-3p表達下調(diào)并靶向nemo樣激酶抑制腫瘤細胞侵襲［6，14］。在其他疾病中miR-362-3p通過靶向ADAMTS1抑制血管平滑肌細胞的遷移［8］；miR-362-3p靶向Pax3抑制滋養(yǎng)層細胞的增殖、遷移和侵襲［9］。然而，miR-362-3p通過哪些靶基因促進喉癌細胞的遷移作用需進一步研究證實。

綜上所述，miR-362-3p在喉癌組織中表達上調(diào)，促進喉癌細胞遷移，提示其在喉癌發(fā)生中發(fā)揮潛在癌基因作用，本研究為進一步探討miR-362-3p表達在喉癌細胞遷移的分子機制提供了重要線索。