孫梓程，陳海軍，劉 巖，范德標(biāo)，尹中波，關(guān)紅偉(南通市第六人民醫(yī)院普外科，南通 60；南通市第六人民醫(yī)院病理科；南通市第六人民醫(yī)院信息科)

大腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，發(fā)病率逐年遞增，嚴(yán)重威脅著國民健康安全[1]。大腸癌起病隱匿，多數(shù)患者確診時已步入晚期。流行病學(xué)研究證實[2]，大腸癌病發(fā)隱匿特征使得約30%患者確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，探討大腸癌病發(fā)及轉(zhuǎn)移的分子機制并為靶向治療提供新思路至關(guān)重要。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞在特定病理和生理情況下向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，EMT已被證實與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移遷移密切相關(guān)。特異性泛素肽酶22(ubiquitin-specific peptidase 22，USP22)是一種新型的去泛素化水解酶[3]。研究證實[4]，USP22信號通路的表達可促使大腸癌細胞獲得干細胞樣表型，進而促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，但其具體調(diào)控分子機制仍尚未明確。miRNAs是大約有22個核苷酸長度的非編碼RNA，已被證實在諸多癌癥的惡性分化、增殖、遷移過程中扮演重要角色[5]。miR-365是一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA，已被證實在胃癌、肺癌和肝癌等惡性腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮生物學(xué)功能[6]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，miR-365與USP22的表達呈負(fù)相關(guān)。但miR-365能否通過靶向調(diào)控USP22的表達，進而通過影響組蛋白泛素化修飾并促進EMT過程，最終使大腸癌發(fā)生惡性轉(zhuǎn)移仍缺乏系統(tǒng)報道。基于此背景，本研究擬從miR-365對USP22的靶向調(diào)控機制角度探討大腸癌轉(zhuǎn)移的分子機制，為靶基因的篩選奠定基礎(chǔ)，為臨床上實現(xiàn)對大腸癌轉(zhuǎn)移的有效干預(yù)提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

大腸癌高轉(zhuǎn)移細胞系HCT-116、LoVo和中低轉(zhuǎn)移細胞系SW480細胞均購自中國科學(xué)院上海細胞庫。miR-365模擬物和miR-365抑制物購自廣州市銳博生物科技有限公司；Transfection Kit和miRNA NC購自上海美軒生物科技有限公司。miRNA Isolation Kit購自上海恒斐生物科技有限公司；miRNA檢測試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄引物購自青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司；DEME培養(yǎng)基、RPMI1640和胎牛血清購自北京華研世佳質(zhì)檢科技有限公司?？菇M蛋白H2B抗體、泛素化組蛋白H2A抗體(Lys119)、抗組蛋白H2A抗體、泛素化組蛋白H2B抗體(Lys120)均購自上海江萊生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(高糖)培養(yǎng)HCT-116、LoVo和SW480細胞。HCT-116、LoVo和SW480細胞，在5%CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期傳代。將SW480細胞接種到6孔板并嚴(yán)格按照試劑盒說明進行miR-365抑制物、模擬物和miR-NC的轉(zhuǎn)染操作，分別分為miR-365抑制物組、miR-365模擬物組和NC組，連續(xù)轉(zhuǎn)染48 h。每組設(shè)置5個復(fù)孔。

1.3 采用RT-PCR檢測miR-365和USP22 mRNA水平

采用Trizol提取大腸癌細胞中總RNA，并嚴(yán)格按照試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄操作，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行后續(xù)操作。PCR反應(yīng)條件為：70 ℃ 35 s、58 ℃ 35 s、95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 min，共35個循環(huán)，所有實驗均重復(fù)4次，最后取平均值。引物序列見表1。以GAPDH管家基因作為對照檢測USP22mRNA，以U6作為miR-365的內(nèi)部對照。USP22和miR-365 mRNA的表達采用2-ΔΔCt方法進行計算。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR

1.4 采用雙熒光素酶報告基因檢測miR-365與USP22的相互作用

將SW480細胞接種于6孔板，細胞匯合度達60%后嚴(yán)格按照試劑盒說明進行轉(zhuǎn)染，分組如下：miR-365+USP22-mut組、miR-NC+USP22-mut組、miR-365+USP22-wt組和miR-NC+USP22-wt組。48 h后收集細胞并檢測熒光素酶活性，檢測采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒。

1.5 采用Western blot法檢測USP22信號通路下游EMT相關(guān)蛋白表達

采用Western blot法檢測miR-365抑制物組、miR-365模擬物組和NC組SW480細胞中Vimentin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達情況，具體方法為：收集大腸癌SW480細胞后，采用細胞裂解液提取細胞中總蛋白約30 μg，隨后進行凝膠電泳分離和轉(zhuǎn)移，并在5%脫脂牛奶中封閉1 h，并在4 ℃條件下過夜孵育。次日進行二抗孵育，在室溫下進行緩沖液清洗。孵育1 h后再次沖洗，進行顯影液曝光顯影，試劑采用增強化學(xué)發(fā)光試劑。蛋白表達實驗重復(fù)進行4次，最后計算平均值。

1.6 采用斑點雜交法檢測H2A和H2B蛋白泛素化修飾

采用斑點雜交法[7]檢測miR-365抑制物組、miR-365模擬物組和NC組SW480細胞中H2BKl20ub(組蛋白H2B作為內(nèi)參)和H2AK119ub(組蛋白H2A作為內(nèi)參)水平，即取50 μl SW480細胞加到硝酸纖維素膜上，經(jīng)麗春紅S染膜液出現(xiàn)紅色斑點證實蛋白結(jié)合到硝酸纖維素膜上。避光洗膜后，使用Odyssey近紅外成像系統(tǒng)檢測蛋白表達，并對每個斑點的熒光強度進行準(zhǔn)確的定量分析，最終結(jié)果由目的蛋白/內(nèi)參蛋白獲得。

1.7 細胞劃痕實驗檢測細胞轉(zhuǎn)移能力

收集miR-365抑制物組、miR-365模擬物組和NC組轉(zhuǎn)染后細胞，將細胞放置于5%CO2孵箱37 ℃培養(yǎng)24 h，待細胞融合率達到90%左右時，在垂直方向，用1 ml微量移液器槍頭在6孔板底部做橫線劃痕，劃下的細胞經(jīng)PBS沖洗去除，之后細胞繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)后24 h，于倒置光學(xué)顯微鏡下拍照觀察，并計算劃痕愈合率：劃痕愈合率=(劃痕后即刻的劃痕面積-劃痕后48 h的劃痕面積)/劃痕后即刻的劃痕面積×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.8 Transwell實驗檢測細胞遷移能力

Transwell實驗分為miR-365抑制物組、miR-365模擬物組和NC組。將細胞濃度調(diào)整至2.0×105個/ml，調(diào)整方案采用無血清培養(yǎng)基制備細胞懸液；隨后在Transwell小室下層加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μl，并將調(diào)整好的細胞接種至Transwell小室上層，培養(yǎng)48 h。隨后采用95%乙醇固定30 min，染色后讀取細胞數(shù)。最后細胞數(shù)確定方案：隨機選取5個視野，取視野中平均值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同大腸癌細胞株中miR-365 mRNA的表達

HCT-116和LoVo細胞系中miR-365 mRNA表達量顯著低于SW480細胞系(P<0.05，見圖1)。轉(zhuǎn)染后，與NC組比較，miR-365抑制物組miR-365 mRNA的表達顯著降低，而miR-365模擬物組則升高(P<0.05，見圖2)。

與HCT-116和LoVo細胞系相比較，*P<0.05圖1 RT-PCR法檢測不同大腸癌細胞株中miR-365 mRNA的表達Figure 1 Expression of miR-365 mRNA in different colorectal cancer cell lines by RT-PCR

與NC組相比較，*P<0.05圖2 RT-PCR法檢測miR-365在轉(zhuǎn)染后大腸癌細胞系SW480的表達Figure 2 Expression of miR-365 in colorectal cancer cell line SW480 after different transfection by RT-PCR

2.2 miR-365和USP22的靶向關(guān)系

雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后miR-NC+USP22-wt熒光素酶活性明顯高于miR-365+USP22-wt(P<0.05)，而miR-365+USP22-mut組和miR-NC+USP22-mut組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖3)。

與miR-365+USP22-wt相比較，*P<0.05圖3 雙熒光素酶報告基因檢測miR-365和USP22的靶向關(guān)系Figure 3 Targeting relationship between miR-365 and USP22 verified by double luciferase reporter gene

2.3 miR-365對SW480細胞中USP22 mRNA表達的影響

RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，與NC組比較，miR-365抑制物組SW480細胞中USP22 mRNA的表達量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05，見圖4)。

與NC組相比較，*P<0.05圖4 RT-PCR法檢測miR-365對SW480細胞中USP22 mRNA表達的影響Figure 4 Effect of miR-365 on the expression of USP22 mRNA in SW480 cells detected by RT-PCR

2.4 miR-365對H2A和H2B蛋白泛素化修飾水平的影響

與NC組比較，miR-365抑制物組H2AK119ub表達量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05，見圖5)；與NC組比較，miR-365抑制物組H2BK120ub表達量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05，見圖5)。

與NC組相比較，*P<0.05圖5 斑點雜交法檢測H2A和H2B蛋白泛素化修飾水平Figure 5 H2A and H2B protein modification level detected by dot blot hybridization

2.5 miR-365對EMT相關(guān)蛋白表達水平的影響

與NC組比較，miR-365抑制物組SW480細胞中N-cadherin蛋白表達量顯著降低，而miR-365模擬物組則升高(P<0.05)；與NC組比較，miR-365抑制物組SW480細胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表達量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05，見圖6)。

與NC組相比較，*P<0.05圖6 Western blot法檢測不同轉(zhuǎn)染后SW480細胞中EMT相關(guān)蛋白表達水平Figure 6 EMT-related protein expression in SW480 cells after different transfection detected by Western blot

2.6 miR-365對細胞轉(zhuǎn)移的影響

與NC組比較，miR-365抑制物組愈合率明顯升高(P<0.05)，而miR-365模擬物組明顯降低(P<0.05，見圖7)，提示SW480細胞的轉(zhuǎn)移能力被明顯增強。

與NC組相比較，*P<0.05圖7 細胞劃痕實驗檢測不同轉(zhuǎn)染后SW480細胞轉(zhuǎn)移能力Figure 7 Cell metastasis of SW480 cells after different transfection by cell scratch test

2.7 Transwell檢測miR-365對SW480細胞遷移的影響

與NC組比較，視野下miR-365抑制物組SW480細胞穿模數(shù)量明顯升高，miR-365模擬物組明顯降低(P<0.05，見圖8，9)，表明miR-365的表達降低有利于SW480細胞的遷移。

圖8 Transwell實驗檢測miR-365對SW480細胞遷移能力的影響Figure 8 Cell migration of SW480 cells after different transfection by Transwell test

與NC組相比較，*P<0.05圖9 Transwell實驗檢測不同轉(zhuǎn)染后SW480細胞穿模數(shù)量Figure 9 The number of SW480 cells penetrating the mold after different transfection by Transwell test

3 討論

近來隨著輔助治療手段的更新、靶向分子藥物的研發(fā)和外科技術(shù)的進步大腸癌的死亡率得到改善，但仍處于較高水平。遠處轉(zhuǎn)移是大腸癌患者死亡的重要因素[8]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要病理過程，上皮細胞發(fā)生EMT使細胞間連接解體，導(dǎo)致細胞形態(tài)改變使間質(zhì)標(biāo)志物表達上升，而上皮標(biāo)志物表達逐漸降低，引起細胞外基質(zhì)重構(gòu)及基底膜降解，使得腫瘤細胞失去細胞間的上皮極性和黏附作用，從而獲得侵襲和遷移的能力[9-11]。大腸癌作為起源于上皮的惡性腫瘤，研究證實，其遷移前沿的病理組織中存在EMT樣的腫瘤細胞[12]。USP22是最新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)基因，與腫瘤的增殖、遷移等過程密切相關(guān)[13]。Zhang等[14]證實，USP22的表達上調(diào)與EMT相關(guān)蛋白表達被激活十分相關(guān)。鮑潔等[15]證實，miR-101可靶向調(diào)控USP22水平影響肝癌MHCC97H細胞的EMT病理過程，進而影響腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)，USP22的異常表達與結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而大腸癌患者USP22表達的調(diào)控機制仍尚未明確。miRNA作為小的非編碼RNA，是大腸癌轉(zhuǎn)移發(fā)生、發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子[17]。Hong等[18]證實，結(jié)直腸癌患者中miR-31-5可通過靶向調(diào)節(jié)NUMB抑制HT29細胞的增殖、遷移和侵襲。Jian等[19]發(fā)現(xiàn)，大腸癌患者循環(huán)miR-15b的高豐度與腫瘤轉(zhuǎn)移十分相關(guān)。miR-365是miRNA家族一員，被證實與肝癌、非小細胞肺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等疾病的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移有關(guān)，但在大腸癌中仍未見報道，尤其USP22信號通路是否為miR-365的靶基因亦未見系統(tǒng)報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，在大腸癌高轉(zhuǎn)移細細胞株miR-365 mRNA的表達明顯低于中低轉(zhuǎn)移的細胞株。選取中低轉(zhuǎn)移的SW480的細胞進行miR-365過表達和敲低模型構(gòu)建，并采用Transwell實驗證實，與miRNA-NC組比較，miR-365抑制物組SW480的細胞侵襲能力顯著升高，模擬物組明顯降低，同時細胞劃痕實驗結(jié)果顯示與NC組比較，miR-365抑制物組愈合率明顯升高，miR-365模擬物組顯著降低，表明在大腸癌的基礎(chǔ)病理發(fā)展中，miR-365扮演著抑癌基因的作用，與文獻報道的結(jié)論基本一致[20，21]。本課題前期實驗發(fā)現(xiàn)USP22的3’UTR區(qū)有miR-365的特異性調(diào)控位點，且大腸癌組織中miR-365的表達與USP22的表達呈負(fù)相關(guān)。為深入明確miR-365的作用機制，本次課題采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，miR-NC+USP22-wt熒光素酶活性明顯高于miR-365+USP22-wt，而miR-365+USP22-mut組和miR-NC+USP22-mut組比較無顯著差異，提示大腸癌細胞中miR-365和USP22基因的表達存在靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。同時本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，USP22與組蛋白的泛素化修飾存在相關(guān)性，推測USP22的表達改變后可通過調(diào)控組蛋白的泛素化修飾，進而影響腫瘤細胞EMT過程，最終促進腫瘤細胞侵襲過程發(fā)生。為驗證上述科學(xué)假說和深入分析miR-365調(diào)控大腸癌細胞遷移的機制，本次課題采用斑點雜交法檢測H2B和H2A的泛素化修飾水平，結(jié)果顯示與NC組比較，miR-365抑制物組H2AK119ub表達量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05)；與NC組比較，miR-365抑制物組H2BK120ub表達量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05)；同時與NC組比較，miR-365抑制物組SW480細胞中N-cadherin蛋白表達量顯著降低，而miR-365模擬物組則升高(P<0.05)；與NC組比較，miR-365抑制物組SW480細胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表達量顯著升高，而miR-365模擬物組則降低(P<0.05)，證實miR-365在大腸癌病理發(fā)展過程中扮演抑癌基因角色。

綜上所述，miR-365在大腸癌細胞轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，為后續(xù)研究大腸癌的發(fā)病機制及分析靶向藥物的研究奠定了基礎(chǔ)。然而本次實驗仍存在不足，如本次課題僅從細胞水平開展了立體實驗，故今后仍需進一步從動物水平設(shè)置在體實驗予以論證。