高天，余鈴，李舒，劉佳勇，白楚杰，薛瑞峰，張路，方志偉，樊征夫

（1. 北京大學腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所骨與軟組織腫瘤科，惡性腫瘤發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點實驗室，北京 100142； 2. 武漢大學人民醫(yī)院骨1科，武漢 430060）

滑膜肉瘤是一種臨床上常見的高度惡性軟組織肉瘤，好發(fā)于青壯年且多在關節(jié)周圍［1-2］。盡管手術聯(lián)合放化療的治療手段使患者5年生存率達到60%，10年生存率仍然極低［3］。Notch信號通路是一種進化中高度保守的跨膜受體信號通路家族，其所編碼的單鏈跨膜受體蛋白在細胞的分化、個體發(fā)育的中起關鍵作用［4］。Notch信號通路包括Notch受體、配體、修飾蛋白及靶點轉(zhuǎn)錄因子。配體與受體結合后，Notch受體發(fā)生裂解并釋放Notch受體胞內(nèi)段（Notch intracellular domain，NICD），隨后NICD進入細胞核調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄［5］。研究［6-8］發(fā)現(xiàn)Notch信號通路的失調(diào)控參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如血液系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、胰腺癌等。Notch信號通路對滑膜肉瘤的影響尚未見報道，本研究擬探討Notch通路相關蛋白在滑膜肉瘤細胞SW982中的表達狀態(tài)及Notch通路對SW982細胞增殖及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人滑膜肉瘤細胞株SW982購自美國菌種保藏中心 （American Type Culture Collection，ATCC）。SW982細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1% 100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的L-15專用培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染

NICD1過表達、CBF1-shRNA慢病毒和陰性對照病毒均購自上海吉凱基因化學技術有限公司。根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染手冊對滑膜肉瘤細胞進行轉(zhuǎn)染，從而得到SW982-Notch上調(diào)、W982-Notch下調(diào)細胞株。轉(zhuǎn)染的細胞培養(yǎng)72 h后，用嘌呤霉素 （3 μ g/mL） 孵育48 h。篩選后的滑膜肉瘤細胞株即為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。

1.3 CCK-8實驗

細胞分為SW982正常對照組、SW982-Notch上調(diào)組、W982-Notch下調(diào)組和DAPT處理組。收集各組細胞制成細胞懸液，用PBS調(diào)整細胞密度至1×105/mL。接種于96孔板中，每孔200 μ L，培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后分別加入終濃度1、2、4、8 μ mol/L的DAPT，轉(zhuǎn)染組細胞直接培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μ L CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h。采用酶標儀檢測450 nm處的光密度值 （optical density，OD），計算細胞增殖率，每組實驗均重復3次。

1.4 劃痕實驗

將各組細胞用L-15專用培養(yǎng)基 （含10%胎牛血清） 培養(yǎng)于6孔板上，待融合后，用滅菌槍頭劃直線，劃痕后 0～24 h，用反轉(zhuǎn)的 Olympus IX50 顯微鏡通過10 倍物鏡和Image-ProPlus軟件捕獲測量劃痕面積。所有實驗重復 3 次，劃痕面積越大，表示遷移能力越弱。

1.5 qPCR檢測NOTCH-1、 HES-1、 HES-5、 HEY-1基因mRNA表達水平

按照Invitrogen公司的Trizol操作說明書進行操作，抽提完成后，加入20 μ L無RNA酶水，至完全溶解，紫外分析測定所抽提RNA的濃度。取5 μ g按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板PCR擴增NOTCH-1、HES-1、HES-5和HEY-1，以GAPDH為內(nèi)參照。各基因引物序列如下：NOTCH-1：5’-GGCACT TTCTGTGAGGAGGAC-3’，5’-GCAGTCAGGCGTGTT GTTCT-3’。HES-1：5’-ATTCTGGAAATGACAGTGA AGCAC-3’，5’-CACCTCGGTATTAACGCCCTC-3’。HES-5：5’-GAAGCCGGTGGTGGAGAA-3’，5’-GCTTG GAGTTGGGCTGGTG-3’。 HEY-1：5’-GAAGCAGG TAATGGAGCAAGGA-3’，5’-GAAGCGTAGTTGTTGA GATGCG-3’。GAPDH：5’-ACTTTGGTATCGTGGAA GGACTCAT-3’，5’-GTTTTTCTAGACGGCAGGTCAG G -3’。PCR反應條件：預變性94 ℃ 5 s，94 ℃ 30 s，-60 ℃ 30 s，-72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)； 溶解曲線條件：95 ℃ 15 s，-60 ℃ 30 s，-95 ℃ 15 s。 基因相對表達水平通過2-△△Ct法計算。

1.6 Western blotting法檢測NOTCH-1及HES-1蛋白表達水平

取各組細胞棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3 次，提取細胞蛋白并定量。取適量裂解產(chǎn)物，以1∶4比例加入樣品與緩沖液，進行SDS-PAGE，電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應一抗于4 ℃孵育4 h，TBST 洗滌20 min；加入相應二抗于室溫孵育1 h，TBST 洗滌20 min；顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。

1.7 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結果采用±s表示，組間差異采用單因素方差分析，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Notch信號通路相關蛋白在滑膜肉瘤細胞SW982中表達增高

NOTCH-1受體和目的基因 HES-1、 HES-5及HEY-1 在人滑膜肉瘤細胞SW982中mRNA表達水平明顯高于正?；ぜ毎謩e較對照組提高1.67±0.36、1.75±0.48、1.56±0.21和1.62±0.25倍，差異有統(tǒng)計學意義 （P < 0.05，圖1A）。Western blotting結果同樣顯示，NOTCH-1蛋白和其目的基因HES-1在人滑膜肉瘤細胞SW982中表達水平顯著高于正?；ぜ毎?（圖1B）。

2.2 上調(diào)Notch信號通路對滑膜肉瘤細胞SW982增殖及侵襲的影響

圖1 正?；ず蚐W982細胞中Notch通路相關基因表達Fig.1 Expression of Notch signaling pathway related genes in normal synovial cells and SW982 cells

利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術構建NICD1持續(xù)表達的細胞SW982株。通過qPCR和 Western blotting 技術對NICD1表達發(fā)揮的Notch信號通路激活作用進行驗證。qPCR結果顯示，NOTCH-1及其靶基因HES-1，HES-5，HEY-1的mRNA表達量明顯增高，平均較對照組提高1.58±0.27倍，差異有統(tǒng)計學意義 （P <0.05，圖2A）。Western blotting驗證也發(fā)現(xiàn)蛋白表達水平與mRNA表達相符 （圖2B）。對Notch上調(diào)細胞SW982及對照細胞SW982進行增殖能力測定，CCK8結果顯示，24～72 h時間范圍內(nèi)Notch上調(diào)的細胞SW982增殖能力明顯強于對照細胞SW982，24 h、48 h及72 h較對照組分別提高1.24±0.08、1.48±0.18和1.72±0.47倍，差異有統(tǒng)計學意義 （P < 0.05，圖2C）。劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，Notch上調(diào)的細胞SW982侵襲能力與對照細胞SW982在24h無明顯差別。但在48 h時，Notch上調(diào)的細胞SW982遷移距離明顯長于對照細胞SW982 （圖2D）。

圖2 過表達NICD1上調(diào)Notch通路活性，增加SW982的增殖和侵襲能力Fig.2 The proliferation and invasion of SW982 cells were upregulated following NICD1 overexpression

2.3 下調(diào)Notch信號通路對滑膜肉瘤細胞SW982增殖及遷移的影響

利用qPCR技術進行驗證，下調(diào)組靶基因mRNA水平僅為對照組的46.3%±10.0%，差異有統(tǒng)計學意義 （P < 0.05，圖3A），Western blotting實驗也驗證了上述結果 （圖3B）。對Notch下調(diào)的細胞SW982及對照細胞SW982進行增殖能力測定，CCK8結果顯示，24～72 h時間范圍內(nèi)Notch下調(diào)的細胞SW982增殖能力明顯低于對照細胞SW982，24 h、48 h及72 h分別為對照組的72.3%±13.2%、57.6%±11.0%和34.6%±7.5%，差異有統(tǒng)計學意義 （P < 0.05，圖3C）。劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，Notch下調(diào)的細胞SW982遷移能力與對照細胞SW982在24 h無明顯差別，48 h時Notch下調(diào)的細胞SW982遷移距離明顯短于對照細胞SW982（圖3D）。

2.4 DAPT對滑膜肉瘤細胞SW982增殖和侵襲的影響

圖3 干擾CBF1表達下調(diào)Notch通路活性，抑制SW982的增殖和侵襲能力Fig.3 The proliferation and invasion of SW982 cells were downregulated following CBF1 knockdown

CCK8檢測發(fā)現(xiàn)，用不同濃度DAPT處理后，細胞SW982在24～72 h時間范圍內(nèi)增殖受到明顯抑制，且抑制作用有明顯劑量依耐性和時間依耐性。在一定范圍內(nèi)，隨著DAPT劑量的增加 （1，2，4，8 μ mol/L） 和作用時間的延長，細胞SW982增殖抑制效果明顯增加，DAPT 8 μ mol/L處理72 h的抑制率可達到87.3%±7.0%，差異有統(tǒng)計學意義 （P < 0.05，圖4A）。

劃痕實驗結果顯示，4 μ mol/L的DAPT孵育細胞SW982 48 h后，細胞遷移的數(shù)量明顯減少。與對照組相比，有統(tǒng)計學差異 （圖4B）。

3 討論

在大多數(shù)滑膜肉瘤中存在特異性的染色體 t（X；18） （p11. 2；q11. 2） 易位，并在斷裂處形成融合基因SYT-SSX［9］，而這種融合基因帶來的下游改變尚不清楚。在FRANCIS等［10］的研究中，對大量的軟組織肉瘤樣本行基因表達譜分析，其中包括31 例滑膜肉瘤的樣本，結果發(fā)現(xiàn)，在滑膜肉瘤中差異表達的基因參與Notch、Hh和Wnt等信號通路，其中NOTCH-1和JAG1 明顯上調(diào)。本研究結果與其一致，滑膜肉瘤細胞SW982中NOTCH-1及其下游基因HES-1、HES-5和HEY-1表達明顯高于人源滑膜細胞，提示Notch信號通路在滑膜肉瘤細胞處于激活狀態(tài)。

圖4 DAPT抑制SW982細胞的增殖和侵襲Fig.4 The proliferation and invasion of SW982 cells were downregulated by DAPT

本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術上調(diào)和下調(diào)Notch信號通路，結果顯示，下調(diào)Notch信號通路后SW982細胞增殖及遷移明顯受到抑制，而上調(diào)得到的結果完全相反。磷酸酶及張力蛋白同源的基因 （phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome 10，PTEN） 作為抑癌基因發(fā)生突變，其與 Notch 通路的關系在多種腫瘤中得到證實。如在乳腺癌中，Notch信號通路通過下調(diào)PTEN表達水平，導致ERK1/2信號轉(zhuǎn)導的過度激活，從而參與曲妥珠單抗耐藥［11］；而在胃癌中，通過抑制Notch信號通路，可上調(diào)PTEN活性，從而誘導胃癌G2/M細胞周期阻滯［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，滑膜肉瘤中NOTCH-1上調(diào)，推測其可能導致PTEN基因的降低，從而發(fā)揮腫瘤促進作用。

Notch 信號通路無須第二信使，γ-分泌酶抑制劑能夠靶向阻斷活化的 Notch 受體從胞膜脫落，抑制下游靶基因激活［13-14］。在非小細胞肺癌移植瘤的模型中發(fā)現(xiàn)， γ-分泌酶抑制劑能夠有效抑制腫瘤生長，且停藥后仍然發(fā)揮著抗腫瘤作用［15］。同時，研究［16］也證實γ-分泌酶抑制劑對于軟組織肉瘤具有抑制作用，如γ-分泌酶抑制劑可減少硬纖維瘤細胞的遷移和侵襲，并可導致其細胞周期阻滯，一項I期臨床試驗表明γ-分泌酶抑制劑用于硬纖維瘤患者中，可取得較好的療效［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，滑膜肉瘤中Notch 通路被過激活，因此，推測其抑制劑也可能對滑膜肉瘤發(fā)揮抑制效果。為了進一步檢測γ-分泌酶抑制劑對于滑膜肉瘤的抑制效果，本研究采用DAPT處理SW982細胞，結果發(fā)現(xiàn)其增殖受到明顯抑制。隨后對Notch信號通路是否能影響SW982細胞遷移進行研究，與設想一致，DAPT處理SW982細胞48 h后，SW982遷移能力同樣明顯被削弱。上述結果高度提示Notch信號通路在滑膜肉瘤細胞SW982中扮演促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的角色。

盡管如此，本研究仍具有一定局限性。第一，未能將Notch信號通路抑制劑與臨床化療藥物聯(lián)合應用觀察對滑膜肉瘤細胞SW982的影響；第二，Notch信號通路是否能影響滑膜肉瘤細胞SW982體內(nèi)的增殖和侵襲能力未知，需要后續(xù)的動物實驗繼續(xù)探究；第三，Notch 本身受體及配體類型較多，本研究證實，NOTCH-1在滑膜肉瘤的增殖侵襲中發(fā)揮重要作用，但與之相關的配體尚需進一步研究。相信隨著 Notch 分子生物學的進一步研究，將為包括滑膜肉瘤在內(nèi)的軟組織腫瘤的診斷和治療提供新思路和實驗依據(jù)。