高楊

摘?要：由丹東東港市某養(yǎng)殖場(chǎng)患病的南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）幼蝦組織體內(nèi)分離出一株優(yōu)勢(shì)菌，通過全自動(dòng)細(xì)菌分析儀及16s rDNA序列分析對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，命名為DS180707。并進(jìn)行人工感染試驗(yàn)和藥敏實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，本次患病幼蝦致病菌為溶藻弧菌，且具有較強(qiáng)的致病性。該菌對(duì)氟苯尼考、氯霉素 、恩諾殺星、諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等6種抗生素敏感。

關(guān)鍵詞：南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）;溶藻弧菌;藥敏實(shí)驗(yàn)

南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）又叫做凡納賓對(duì)蝦或白腳蝦[1]，原產(chǎn)于中、南美太平洋沿岸水域。1988年中科院海洋研究所首次從美國引進(jìn)南美白對(duì)蝦[2]，由于其生長速度快、抗病能力強(qiáng)[3]，成為世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的品種之一。丹東地處河口地區(qū)，海、淡水資源豐富，適合南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖。

隨著淡水高密度養(yǎng)殖模式的興起，南美白對(duì)蝦的病害也頻繁發(fā)生。南美白對(duì)蝦細(xì)菌性疾病的主要原因是弧菌病[1]。筆者從丹東東港市某養(yǎng)殖場(chǎng)患病的南美白對(duì)蝦以及池塘水樣進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定，水質(zhì)理化指標(biāo)測(cè)定，16s rDNA序列分析及藥敏試驗(yàn)，為南美白對(duì)蝦弧菌病的研究提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

2018年7月，東港市某白對(duì)蝦養(yǎng)殖戶反應(yīng)養(yǎng)殖的南美白對(duì)蝦行動(dòng)遲緩、生長緩慢。筆者現(xiàn)場(chǎng)取患病南美白對(duì)蝦150尾，體長約3～5 cm。健康幼蝦取自東港市某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?肉眼檢查及剖檢?將患病幼蝦通過肉眼觀察體表癥狀，解剖頭胸甲進(jìn)行鏡檢，并記錄。

1.2.2?細(xì)菌分離?在無菌條件下[4]，將患病幼蝦分為10組，分別進(jìn)行組織勻漿處理。用接種針接種于胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基和硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（TCBS）培養(yǎng)基上，劃線分離，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢(shì)菌的單菌落，在TSA平板上純化培養(yǎng)3次。

1.2.3?細(xì)菌鑒定

1.2.3.1?分子生物學(xué)鑒定?對(duì)分離菌株進(jìn)行常規(guī)16s rDNA基因序列鑒定，將得到的產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)。選取同源性較高的序列，采用 Clustal X 1.83軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，并通過MEGA 6軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3.2?生化鑒定?采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行生化特征分析。

1.2.4?人工感染試驗(yàn)?試驗(yàn)蝦為東港地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)健康幼蝦200尾，體長2～3 cm，暫養(yǎng)于200 L水族箱中，溫度控制在26 ℃，鹽度1.5‰，連續(xù)充氧。試驗(yàn)組與對(duì)照組各10 L水體分別放入50尾仔蝦，試驗(yàn)組水體中的細(xì)菌密度調(diào)至108cfu/mL，對(duì)照組不加入菌體。每日正常投喂，并觀察記錄發(fā)病癥狀及死亡情況。

1.2.5?藥敏試驗(yàn)?采用藥敏紙片法。

1.2.6?水質(zhì)理化指標(biāo)的測(cè)定?用水質(zhì)分析儀（YSI）檢測(cè)水體水溫、溶解氧、鹽度、pH。用7500儀器檢測(cè)氨氮、亞硝酸鹽、磷酸鹽、化學(xué)耗氧量。

2?結(jié)果與分析

2.1?病原形態(tài)特征

自南美白對(duì)蝦組織中分離獲得一株細(xì)菌，命名為DS180707，純化后在TSA平板上呈現(xiàn)為圓形光滑、黃色突起的菌落。革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察為革蘭氏陰性菌。

2.2?病原菌的生理、生化鑒定

由全自動(dòng)細(xì)菌分析儀對(duì)病原菌的生理生化檢測(cè)結(jié)果可知，該病原菌初步鑒定為溶藻弧菌（V.alginolyticus）。

2.3?菌株16s rDNA 基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將分離菌所擴(kuò)增的16s rDNA基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)結(jié)果顯示，菌株 DS180707基因與溶藻弧菌相應(yīng)基因相似率達(dá)99%。將分離菌所擴(kuò)增的16s rDNA基因序列提交到Gen Bank，獲得序列號(hào)為MK217413，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株DS180707與溶藻弧菌聚為一支。

2.4?人工感染試驗(yàn)

人工感染48 h后，南美白對(duì)蝦開始出現(xiàn)死亡，72 h死亡率達(dá)50%。取感染后死亡幼蝦勻漿處理后進(jìn)行細(xì)菌分離，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、生化鑒定及分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果顯示分離菌株與原感染菌株為同一種致病菌。

2.5?藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，溶藻弧菌DS180707對(duì)氟苯尼考、氯霉素 、恩諾殺星、諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等抗生素敏感，對(duì)慶大霉素、多西環(huán)素、青霉素、制霉菌素耐藥（表1）。

2.6?水質(zhì)理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖最適[5]溫度為 24～32 ℃，pH為7.5～8.5，溶解氧 5 mg/L以上。根據(jù)水質(zhì)理化指標(biāo)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4]可知，該養(yǎng)殖水質(zhì)中氨氮和活性磷含量超標(biāo)（表2）。

3?討論

作者首次從丹東地區(qū)患病的南美白對(duì)蝦體內(nèi)分離出溶藻弧菌，并命名為DS180707。該菌對(duì)多種水生生物[6]均能造成危害。通過人工感染試驗(yàn)可知，該菌是致病菌，也是對(duì)蝦細(xì)菌病的主要病原之一，能引起對(duì)蝦攝食率下降，爛鰓黑鰓[7-9]，游動(dòng)緩慢等癥狀。該病多發(fā)在夏秋季節(jié)[10]，溫度在25～28 ℃易暴發(fā)流行。該養(yǎng)殖池塘發(fā)病時(shí)已進(jìn)入夏季，是全年氣溫、水溫較高時(shí)期，隨著溫度的上升水產(chǎn)病害明顯增加。且氨氮和活性磷含量過高，氨氮[11]作為養(yǎng)殖水體重要的脅迫因子，含量過高會(huì)造成對(duì)蝦免疫力及抗病力下降，增加對(duì)弧菌的感染性?；钚粤譡12]過高易造成水體富營養(yǎng)化，研究表明，蝦病暴發(fā)前養(yǎng)殖池中的無機(jī)磷含量通常超過閾值。

由藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，溶藻弧菌DS180707對(duì)氟苯尼考、氯霉素、恩諾殺星、諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等6種抗生素敏感。在防治水產(chǎn)生物細(xì)菌性疾病時(shí)不要濫用[13]抗生素類藥物，避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，增加病害控制的難度。確定藥物的最低有效濃度及菌株的耐藥性是下一步工作的方向。

綜上所訴，造成南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖池發(fā)病的主要病原是溶藻弧菌。針對(duì)氨氮和磷酸鹽過高的情況應(yīng)及時(shí)采取措施調(diào)節(jié)。經(jīng)常潑灑碘液和微生態(tài)制劑可以調(diào)節(jié)水質(zhì)，同時(shí)確保充足優(yōu)質(zhì)的餌料供應(yīng)，是提高對(duì)蝦抗病力的主要手段。

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