米雪 韓萍 曹燕花 丁霄

[摘要]目的 研究壬基酚（NP）灌胃染毒對昆明種小鼠卵巢及雌激素（E2）、孕激素（P）水平等的影響，以期評價壬基酚的生殖毒性和發(fā)育毒性。方法 將30只健康的清潔（SPF）級雌性昆明小鼠隨機(jī)分為對照組（玉米油）和25、100 mg/kg NP組，每組10只。采用灌胃方式染毒，染毒容量為0.1 ml/10 g，每天1次，每周染毒5 d，連續(xù)染毒12周。測定各組小鼠血清中的E2、P、FSH并觀察卵巢組織病理切片的變化。結(jié)果 25 mg/kg NP組與對照組小鼠血清中的E2、P、FSH比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），卵巢組織病理切片中初級卵泡和成熟卵泡數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。100 mg/kg NP組與對照組、25 mg/kg NP組小鼠血清中的E2、P、FSH水平以及卵巢組織病理切片中初級卵泡和成熟卵泡數(shù)目比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），初級卵泡發(fā)生萎縮，卵巢顆粒細(xì)胞松散，卵母細(xì)胞核固縮，卵泡腔變小。結(jié)論 NP染毒劑量增大可對小鼠的卵巢功能造成損害，有生殖毒性和發(fā)育毒性。

[關(guān)鍵詞]壬基酚;卵巢;雌激素;促性腺激素

[中圖分類號] R71? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）1（c）-0004-04

壬基酚（nonylphenol，NP）是環(huán)境雌激素的一種，在日常生活中隨處可見，如洗滌劑、柔順劑、滑油添加劑、食用塑料產(chǎn)品以及工業(yè)橡膠制品，其廣泛地存在于生態(tài)環(huán)境中，可以通過皮膚暴露和食物以及污水進(jìn)入人體，并且有蓄積性[1]和持久性，對人體的內(nèi)分泌系統(tǒng)可造成危害，影響人類健康。人類精子質(zhì)量和數(shù)量下降、男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常考慮可能與有雌激素活性的外來化合物有關(guān)[2-4]。研究表明，NP[5]、雙酚 A等雌激素樣物質(zhì)在離體實(shí)驗條件下能明顯促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞 PC-3 增殖，推測與男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常、生殖障礙有密切關(guān)系。全世界的學(xué)者對NP造成的危害越來越重視，已有學(xué)者做過卵巢損傷后儲備功能減退的相關(guān)研究，外界環(huán)境因素能使機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致成熟性卵泡的缺失[6]。郭金蓮等[7]發(fā)現(xiàn)NP劑量達(dá)到100 mg/kg可對大鼠的生殖功能產(chǎn)生抑制，改變激素水平及卵泡數(shù)目。實(shí)驗表明NP還可以對雌性大鼠的免疫[8]功能以及雄性大鼠的生殖[9]功能產(chǎn)生損傷，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[10]。還有證據(jù)表明，高劑量的NP可抑制睪酮[11]的分泌。

目前國內(nèi)外對NP對小鼠卵巢功能氧化損傷的研究較少，故進(jìn)行本研究。

1材料與方法

1.1主要儀器與試劑

KDC-1044 型低速離心機(jī);電子天平;光學(xué)顯微鏡。NP原液（購買于常州染料化工廠，純度>95%），超純水，魯花牌玉米油，雌激素（E2）、孕激素（P）、促性腺激素（FSH）ELISA試劑盒均購于南京建成生物公司。NP染毒溶液的配制：精準(zhǔn)稱取適量的NP溶于玉米油中，配制成濃度分別為2.5、10 mg/ml的NP溶液。

1.2 實(shí)驗的動物的分組及染毒方法

選擇30只健康清潔（SPF）級昆明種雌性小鼠，體重18～22 g，年齡6～8周，動物合格證號：SCXK（京）2014-0004，由華北理工大學(xué)動物實(shí)驗中心提供。室溫22～24℃，濕度合適，通風(fēng)系統(tǒng)正常的無菌環(huán)境中，喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)顆粒型飼料。實(shí)驗期間小鼠自由攝食飲水。

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將30只小鼠隨機(jī)分為三組[11]，分別為對照組（玉米油），25 mg/kg、100 mg/kg NP組，每組10只。灌胃染毒[12-13]，染毒容量為0.1 ml/10 g，每天1次，每周5 d，連續(xù)染毒12周。每日觀察小鼠的一般精神狀態(tài)、活動、進(jìn)食飲水量等情況，記錄小鼠的體重。

1.3小鼠卵巢重量及其臟器系數(shù)的測定

末次染毒結(jié)束24 h后，稱重并摘眼球取血，迅速分離雙側(cè)卵巢及子宮進(jìn)行稱重，并計算卵巢系數(shù)（卵巢系數(shù)=卵巢重量/體重×100%）;除部分卵巢組織送病理形態(tài)學(xué)檢測外，均凍存于-80℃，備用。

1.4小鼠血清E2、P、FSH水平的的測定

末次染毒結(jié)束24 h后，摘眼球取血后，靜置10 min，離心（2000 r/min）×10 min，取上清液，檢測E2、P、FSH，具體操作步驟嚴(yán)格按照南京建成生物公司所購買的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5小鼠卵巢組織病理學(xué)觀察

每組選取2只小鼠卵巢，常規(guī)固定、脫水、浸透、包埋，制成5 μm厚的切片，乙醇梯度脫水，常規(guī)HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠卵巢組織病理形態(tài)并攝片，鏡下每張切片隨機(jī)選取3個視野，計數(shù)總卵泡數(shù)、初級卵泡數(shù)及成熟卵泡數(shù)和閉鎖卵泡數(shù)目。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫，使用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間比較采用方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況觀察

染毒期間對照組的小鼠精神狀態(tài)良好，皮毛光澤度，活動度，糞便、進(jìn)食飲水量均正常。25 mg/kg NP組大鼠的精神狀態(tài)一般，皮毛光澤度較差，活動稍減少，糞便、進(jìn)食飲水量相對正常。100 mg/kg NP組大鼠的精神狀態(tài)委靡，皮毛光澤度下降，活動明顯減少，進(jìn)食及飲水量減少。

2.2體重變化

染毒第6、12周，25 mg/kg NP組與對照組組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），100 mg/kg NP組與對照組、25 mg/kg NP組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3三組小鼠卵巢濕重及卵巢系數(shù)的比較

25 mg/kg NP組小鼠的卵巢濕重及卵巢系數(shù)與對照組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），100 mg/kg NP組小鼠的卵巢濕重及卵巢系數(shù)與對照組、25 mg/kg NP組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.4三組小鼠血清中E2、P、FSH水平的比較

100 mg/kg NP組小鼠血清中E2、P、FSH水平明顯低于對照組、25 mg/kg NP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;25 mg/kg NP組小鼠血清中E2、P、FSH水平低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

2.5三組卵巢組織卵泡數(shù)目和卵巢病理形態(tài)學(xué)結(jié)果的比較

25、100 mg/kg NP組小鼠卵巢組織總卵泡、初級卵泡、成熟卵泡數(shù)目分別與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表4）。

100 mg/kg NP組小鼠卵巢HE染色，40倍鏡下與對照組比較，原始卵泡及生長卵泡的數(shù)目減少，閉鎖卵泡數(shù)目增多，200倍鏡下可見初級卵母細(xì)胞明顯萎縮，卵巢顆粒細(xì)胞松散，卵母細(xì)胞核固縮，卵泡腔變?。▓D1～4，見封四）。25 mg/kg NP組小鼠卵巢HE染色，200倍鏡下與對照組比較可見少數(shù)初級卵母細(xì)胞，卵巢顆粒細(xì)胞松散，卵母細(xì)胞核固縮（圖5，見封四）。

3 討論

NP主要經(jīng)皮膚及污水進(jìn)入人體，影響人類的內(nèi)分泌系統(tǒng)，證據(jù)表明，圍生期暴露雌激素干擾物可導(dǎo)致出生缺陷及發(fā)育異常[14]。一方面兒童性早熟[15]與NP密不可分。隨著工業(yè)發(fā)展，人們更多地暴露于NP。葉麗杰等[16]的動物實(shí)驗結(jié)果有證據(jù)證明NP經(jīng)口持續(xù)染毒，當(dāng)劑量達(dá)到60 mg/kg時，雄性小鼠的精子數(shù)量減少，活精率下降，畸形率增高。本研究采用昆明種雌性小鼠經(jīng)口染毒的實(shí)驗方法，各染毒組小鼠的體重、卵巢濕重以及卵巢系數(shù)無顯著差異，可能與小鼠種類、特定的生長發(fā)育周期、染毒時間及濃度等不同有關(guān)，尚不能證明兩者之間無明顯關(guān)聯(lián)。各組小鼠卵巢的各級卵泡與對照組比較，均有所減少（P<0.05）。高劑量NP作用下小鼠卵巢的閉鎖卵泡明顯增多，血清中P、FSH較對照組明顯降低（P<0.05）;卵泡閉鎖數(shù)目增多的機(jī)制尚未明確，有人考慮與卵泡微環(huán)境內(nèi)的激素下降，營養(yǎng)支持作用不足有關(guān)，同時伴隨卵母細(xì)胞凋亡和顆粒細(xì)胞排列松散，順序紊亂等[7]。低劑量NP作用下激素水平與對照組比較未見明顯變化（P>0.05），考慮NP有劑量蓄積作用，應(yīng)延長染毒時間。本研究因為樣本量較少，實(shí)驗方法存在誤差和局限性，可增大樣本量，改善實(shí)驗方法以及實(shí)驗儀器的的精準(zhǔn)度，降低實(shí)驗誤差。

綜上所述，NP對小鼠卵巢有生殖毒性和發(fā)育毒性。人類的生育功能下降，是否與NP在日常生活中的暴露量成正相關(guān)，還需進(jìn)行大量的流行病學(xué)調(diào)查和論據(jù)充分有效的動物實(shí)驗。NP類化合物在生活中越來越多，有必要繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)的動物實(shí)驗，進(jìn)一步關(guān)注和明確NP對人類及野生動物生殖健康的危害，從而更有效地預(yù)防。

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（收稿日期：2018-07-23? 本文編輯：許俊琴）