李曉丹 汪建妹 王向軍 楊華 吉小鳳 徐杰 錢(qián)鳴蓉

摘?要?建立了豬肉、豬肝及其脂肪組織中21種三唑類(lèi)殺菌劑的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈提取，濃縮后加水混勻， 經(jīng)PRiME HLB柱凈化，收集流出液， 用UPLC-MS/MS法測(cè)定，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。21種三唑類(lèi)殺菌劑在0.5～100 μg/L濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99; 在3個(gè)添加濃度（2.0、5.0和10.0 μg/kg） 下，各殺菌劑的回收率為69.5%～109.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～10.8%。 此方法前處理操作簡(jiǎn)便，靈敏度高， 精密度好，能較大程度除去基質(zhì)干擾，可用于豬肉、豬肝及其脂肪組織中21種三唑類(lèi)殺菌劑殘留的測(cè)定。

關(guān)鍵詞?超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜; 豬肉; 豬肝; 豬脂肪; 三唑類(lèi)殺菌劑

1?引 言

三唑類(lèi)殺菌劑為有機(jī)雜環(huán)類(lèi)化合物，結(jié)構(gòu)主鏈上含有羥基（酮基）、取代苯基和1，2，4-三唑基團(tuán)，作為一類(lèi)高效、低毒、廣譜的殺菌劑[1]， 廣泛用于蔬菜、水果、稻谷作物等種植與病蟲(chóng)害防治[2]，但同時(shí)也造成其在蔬菜、水果、農(nóng)作物、土壤和水體[3～5]中殘留，影響食品質(zhì)量安全并造成環(huán)境污染[6]。殘留的殺菌劑及其代謝物可通過(guò)食物鏈傳遞，在動(dòng)物組織中富集、累積，使畜禽產(chǎn)品也存在安全隱患，對(duì)消費(fèi)者的健康造成威脅。日本“肯定列表制度”[7]及國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）[8]針對(duì)畜禽產(chǎn)品中的部分三唑類(lèi)殺菌劑設(shè)定了最大殘留限量（MRL），范圍在0.01～2.00 mg/kg之間。我國(guó)食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB2763-2016中僅規(guī)定了部分三唑類(lèi)殺菌劑在植物性食品中的限量標(biāo)準(zhǔn)[9]，尚未對(duì)動(dòng)物性食品中殘留作限定。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于三唑類(lèi)殺菌劑殘留的測(cè)定主要集中在水體、土壤及水果、蔬菜等植物性樣品，樣品凈化通常采用QuEChERS方法[10～12]、固相萃取方法（SPE）[13～17]或分散液液微萃取法（DLLME）[3，18，19]等，檢測(cè)方法有氣相色譜法[14]、液相色譜法[16，17]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[13～15，18]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[17，19]等?，F(xiàn)行關(guān)于三唑類(lèi)殺菌劑的檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[20～22]涉及的基質(zhì)以糧谷類(lèi)、果蔬等植物性食品為主，凈化方式均采用固相萃取技術(shù)，關(guān)于畜禽產(chǎn)品中三唑類(lèi)殺菌劑的檢測(cè)方法較少，缺乏相應(yīng)完善的檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于動(dòng)物性食品的殘留分析方法通常采用較為繁瑣的SPE柱凈化或QuEChERS法結(jié)合其它技術(shù)，Souza等[23]通過(guò)改良QuEChERS法結(jié)合冷凍除脂后用HPLC-MS/MS和GC-MS檢測(cè)肝臟、肌肉中的獸藥和殺蟲(chóng)劑。呂冰等[24]采用乙腈提取，以凝膠滲透色譜和Carb-NH2萃取柱聯(lián)合凈化， 建立肉類(lèi)、水產(chǎn)類(lèi)等動(dòng)物性食品中167種農(nóng)藥殘留的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。本研究將針對(duì)豬肉、豬肝、豬脂肪基質(zhì)中脂肪、蛋白含量高，采用通過(guò)式過(guò)柱法去除脂肪和磷脂，凈化效率高、操作簡(jiǎn)便，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法測(cè)定，方法靈敏度高、重復(fù)性好，可以滿足畜禽產(chǎn)品中三唑類(lèi)殺菌劑的測(cè)定要求，為動(dòng)物源食品的殘留監(jiān)測(cè)與控制提供技術(shù)支撐。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

UPLC-MS/MS配置包括LC 30AD超高壓液相色譜（日本Shimadzu公司）與6500 QTRAP質(zhì)譜（美國(guó)Applied Biosystems公司），并配備Multiquant 3.0數(shù)據(jù)處理軟件; 固相萃取裝置（美國(guó)Supelco公司）; Talboys230v渦旋混合器（美國(guó)Troemner公司）; SorvallPrimoR高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）; KQ5200B超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）; 分析天平（德國(guó)Sartorius公司）; Turbovap LV氮吹濃縮儀（瑞典Biotage公司）; 組織搗碎機(jī)（荷蘭Philips公司）。

固相萃取柱為Oasis ?PRiME HLB（200 mg，6 mL，Waters公司）。甲醇、乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）。甲酸銨（色譜純，迪馬公司）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（美國(guó)Millipore公司）。三唑類(lèi)殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥98%，名稱見(jiàn)表1）購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司。

準(zhǔn)確稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的21種三唑類(lèi)殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別用甲醇溶解并定容至100 mL，濃度為100 mg/L，儲(chǔ)備液儲(chǔ)存于20℃，有效期為12個(gè)月。用空白樣品提取液配成不同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液保存于4℃，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2?樣品處理

2.2.1?樣品制備?豬肉、豬肝和豬脂肪樣品購(gòu)自本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，樣品先切碎成小塊，隨后用組織搗碎機(jī)搗碎成勻漿，置于分裝袋中， 20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2?樣品前處理?稱取5 g（精確到0.01 g）試樣至50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混合，超聲提取5 min，以8000 r/min離心3 min，收集上清液，殘?jiān)?0 mL乙腈進(jìn)行二次提取。合并兩次提取液，于50℃水浴中氮吹至4 mL，然后用水定容至5 mL，渦旋混勻，過(guò)PRiME HLB柱凈化，重力作用下，收集全部流出液。取1 mL流出液，以水定容至2 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

2.3?色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件： BEH-C18柱，（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm， Waters公司）; 柱溫： ?40℃; 進(jìn)樣量： 5 μL; 流速： 0.2mL/min; 流動(dòng)相A為2 mmol/L甲酸銨溶液（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫程序： 0～1 min，70% A; 1～1.1 min，70%～40% A; 1.1～3 min，40% A; 3～8 min，40%～10% A; 8～12 min，10% A; 12～12.1 min，10%～70% A; 12.1～15 min，70% A。

質(zhì)譜條件： 電離模式： 電噴霧電離（ESI+）; 掃描方式： 多反應(yīng)監(jiān)測(cè); 噴霧電壓： 5.0 kV; 氣簾氣： 40 psi （氮?dú)猓? 離子源溫度的550℃; 霧化氣： 50 psi; 輔助加熱氣： 55 psi。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

3?結(jié)果與討論

3.1?色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

以C18柱（100 mm×2.1 mm， 1.7 μm， Waters公司）為分離柱，比較了甲醇、乙腈作為流動(dòng)相以及添加甲酸、甲酸銨對(duì)目標(biāo)物分離行為及響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，采用甲醇-2 mmol/L甲酸銨溶液（含0.1%甲酸）作為流動(dòng)相，梯度洗脫時(shí)，化合物分離效果及峰形較好，靈敏度高。

所有目標(biāo)物在ESI+模式下能獲得較高豐度的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰。在選定的質(zhì)譜條件下進(jìn)行子離子掃描，選取信號(hào)最強(qiáng)最穩(wěn)定的子離子作為定量離子，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式優(yōu)化各種質(zhì)譜參數(shù)，使化合物的準(zhǔn)分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

3.2?樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

3.2.1?提取溶液的選擇?21種殺菌劑藥物極性差異較大。乙腈具有極性大、穿透力強(qiáng)的特點(diǎn)，可減少脂溶性雜質(zhì)的提出，廣泛用于殘留分析中待測(cè)物的提取。王菲等[12]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定5種中藥材中10種三唑類(lèi)殺菌劑，在提取液中加酸有助于提高中藥材中某些三唑類(lèi)殺菌劑的回收率。本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈和酸化乙腈（含1%甲酸或1%乙酸）為提取液時(shí)對(duì)目標(biāo)物的提取效率。通過(guò)加標(biāo)回收法，在空白豬肝中加入21種三唑類(lèi)殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平均為5 μg/kg，混勻靜置24 h后，再加入20 mL提取溶液，3種溶液的提取效率。用含1%甲酸-乙腈（AF）提取，糠菌唑、氟環(huán)唑的回收率低于60%; 用乙腈或1%乙酸-乙腈（AA）提取，各目標(biāo)物回收率范圍為70.0%～93.0%和59.8%～87.3%。其中，乙腈的提取回收率較高，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

3.2.2?提取溶劑體積及提取次數(shù)的優(yōu)化?針對(duì)提取溶劑用量及次數(shù)優(yōu)化，首先考察了10、20和30 mL乙腈對(duì)目標(biāo)化合物的單次提取效率。結(jié)果表明，30與20 mL的提取效率明顯優(yōu)于10 mL，而20與30 mL提取效率差異不明顯。因此，用20 mL乙腈對(duì)樣品進(jìn)行提取。

其次， 比較了總體積為20 mL乙腈分1次、2次和3次提取的效果。通過(guò)對(duì)比21種殺菌劑在不同提取次數(shù)下的回收率，發(fā)現(xiàn)2次以上的提取效果明顯優(yōu)于單次，其中腈苯唑、氟硅唑、戊菌唑和苯醚甲環(huán)唑的回收率提高了19%～28%， 2次提取與3次提取的回收率無(wú)明顯提高。因此，本研究采用10 mL乙腈提取樣品并重復(fù)一次。

3.2.3?凈化條件的優(yōu)化?為降低基質(zhì)效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)先選擇用正己烷進(jìn)行液液分配除脂。在空白豬肝樣品中添加濃度為5 μg/kg的21種三唑類(lèi)殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈提取樣品并濃縮至5 mL，加入5 mL正己烷，充分混勻后于8000 r/min離心3 min。取下層乙腈溶液在氮?dú)饬飨麓抵两桑? mL甲醇復(fù)溶殘?jiān)⒎治?。結(jié)果表明，腈苯唑、滅菌唑、三唑酮等10種目標(biāo)物的回收率低于60%?？赡芤蛏鲜龌衔镌谡和橹腥芙舛容^大，除脂過(guò)程中出現(xiàn)損失。這與胡艷云等[2]用丙酮-乙酸乙酯-正己烷混合提取果蔬中20種三唑類(lèi)農(nóng)藥、顏鴻飛等[11]用丙酮-正己烷振蕩提取水果中的烯唑醇?xì)埩羲鶊?bào)道的結(jié)果相似。鑒于部分三唑類(lèi)殺菌劑易溶于正己烷，因此考慮其它凈化手段。

2017年，Hong等[25]用乙腈和水混合液萃取，PRiME HLB柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定豬肉、牛肉、雞肉和羊肉中44種頭孢菌素。王智等[26]建立了PRiME HLB 固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測(cè)牛肝中18種促生長(zhǎng)劑類(lèi)藥物。其中PRiME HLB柱無(wú)需經(jīng)過(guò)活化和平衡，提取液直接上柱，上柱后，提取液中少量的水可使填料中親水基團(tuán)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，能有效吸附蛋白、脂肪、磷脂等基質(zhì)干擾物，降低了樣品分析的基質(zhì)效應(yīng)，過(guò)程簡(jiǎn)單、快速、高效。因此，本實(shí)驗(yàn)選取PRiME HLB柱進(jìn)行直接通過(guò)式凈化。樣品經(jīng)乙腈提取后，氮吹濃縮至4 mL后，用水定容至5 mL，混勻上柱后，在重力作用下，可收集4.5 mL流出液，與過(guò)柱前相比，凈化后的提取液澄清度顯著提升。

通過(guò)式過(guò)柱凈化過(guò)程中，若不擠干柱體，約有0.5 mL溶液殘留在柱填充物中。為考察柱體中待測(cè)物殘留情況，比較了5 mL提取液上樣后，不擠干（4.5 mL）和擠干后（5.0 mL）流出液中待測(cè)目標(biāo)物的濃度。兩者中待測(cè)物測(cè)定濃度接近，回收率無(wú)明顯差異。但擠出柱中殘余液會(huì)增加流出液中的雜質(zhì)含量，例如，處理豬肝樣品，與未擠干的流出液相比，完全擠干的流出液低溫存放12 h后，會(huì)出現(xiàn)部分絮狀物; 基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)了10%～15%。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用上柱后在重力作用下收集流出液，再進(jìn)行下一步操作。

3.2.4?待測(cè)物溶解液優(yōu)化?實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 增加待測(cè)物溶液中水含量可改善氟康唑峰形，當(dāng)乙腈與水的體積比為4∶6時(shí)，峰形最佳。 同時(shí)， 糠菌唑、環(huán)唑醇、硅氟唑和苯醚甲環(huán)唑等峰形也較對(duì)稱。因此，將柱凈化后的提取液加水稀釋?zhuān)勾郎y(cè)液中乙腈與水體積比接近4∶6。

3.3?基質(zhì)效應(yīng)

動(dòng)物性產(chǎn)品中富含大量蛋白、脂肪等，在殘留測(cè)定過(guò)程中易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。不同基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物離子化程度的影響存在差異。本研究分別比較相同濃度下，三唑類(lèi)殺菌劑在豬肉、豬肝、豬脂肪空白基質(zhì)提取液和溶劑中響應(yīng)值的比值，計(jì)算公式為ME（%）=B/A×100（A為標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值; B為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值），當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)ME值大于或者小于100%時(shí)， 認(rèn)為具有基質(zhì)增強(qiáng)或抑制作用[27]。應(yīng)用優(yōu)化后的方法，豬肉基質(zhì)效應(yīng)為84%～106%，豬脂肪的基質(zhì)效應(yīng)為83%～104%，豬肝對(duì)目標(biāo)物離子化的影響較為顯著，基質(zhì)效應(yīng)為75%～107%，同時(shí)對(duì)21種三唑類(lèi)殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)中間液制備基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與同濃度梯度的溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線也進(jìn)行了比較，其斜率比值在0.6～1.3之間。為降低基質(zhì)效應(yīng)影響，用空白樣品提取液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

3.4?方法的線性范圍與檢出限、定量限

在空白樣品提取液中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L），采用本方法測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，21種三唑類(lèi)殺菌劑在0.5～100 μg/L濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.99。在最低添加水平下，以3倍和10倍信噪比結(jié)合濃度外推法確定方法檢出限和定量限，21種殺菌劑的檢出限（LOD）為0.3～0.6 μg/kg，定量限（LOQ）為1.0～2.0 μg/kg。空白豬肉、豬肝、豬脂肪樣品在2.0、5.0和10.0 μg/kg加標(biāo)濃度下，殺菌劑的平均回收率為69.5%～109.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～10.8%（表2）。

3.5?實(shí)際樣品分析

為評(píng)估本方法的適用性，利用本方法對(duì)羊肉、牛肉、雞肉及肝臟、腎臟、脂肪基質(zhì)進(jìn)行了空白樣品添加回收實(shí)驗(yàn)，添加濃度在2.0～10.0μg/kg之間，回收率為67.3%～110.5%，RSD為2.3%～12.4%， 準(zhǔn)確度和精密度均滿足日常監(jiān)測(cè)的需求。

用本方法檢測(cè)了20個(gè)市售的豬肉、雞肉等畜禽樣品，包括4個(gè)豬肉樣品、4個(gè)豬肝樣品、3個(gè)豬脂肪樣品、4個(gè)雞肉樣品、3個(gè)雞肝樣品和2個(gè)牛肉樣品。其中，1個(gè)雞肉樣品中檢出苯醚甲環(huán)唑，濃度為1.2 μg/kg，未超過(guò)日本所規(guī)定苯醚甲環(huán)唑在動(dòng)物源性食品中最大殘留限量10 μg/kg[7]。

4?結(jié) 論

以豬肉、豬肝及其脂肪為研究對(duì)象，建立了21種三唑類(lèi)殺菌劑的分析測(cè)定方法，樣品經(jīng)乙腈提取，濃縮后加少量水，采用PRiME HLB柱去雜、UPLC-MS/MS分析。方法前處理操作簡(jiǎn)便，靈敏度較高，有效減少了基質(zhì)干擾，能夠滿足日本和CAC對(duì)該類(lèi)殺菌劑的限量要求。同時(shí)，本方法也適用于畜禽產(chǎn)品中肝臟、脂肪和肌肉組織中三唑類(lèi)殺菌劑的檢測(cè)。

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