畢晶晶 李琳琳 麻娜娜 夏丁丁 仉華 張志國(guó) 劉統(tǒng)信 張貴生

摘?要?設(shè)計(jì)并合成了兩個(gè)對(duì)稱的1，2，3-三氮唑類蒽醌衍生物K1、K2， 采用1H NMR、13C NMR和HRMS表征其結(jié)構(gòu)， 并考察了光譜性質(zhì)。利用GaussView 9.0量化程序及含時(shí)密度泛函TD-DFT方法對(duì)K1及K1-Ag+的結(jié)構(gòu)性質(zhì)及理論光譜進(jìn)行了計(jì)算。結(jié)果表明， 計(jì)算與測(cè)得的紫外-可見吸收光譜一致， 在370 nm左右出現(xiàn)蒽醌的吸收峰;熒光光譜表征實(shí)驗(yàn)表明，探針K1與Ag+結(jié)合后，出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰（466和522 nm），466 nm處熒光強(qiáng)度與單獨(dú)K1相比增強(qiáng)9倍; 探針K1在H2O-DMSO （7∶1， V/V， HEPES， pH=7.4）中對(duì)Ag+具有良好的選擇性識(shí)別性能， 常見共存離子及pH值對(duì)其測(cè)定無(wú)明顯影響，通過(guò)Job's plot 曲線確定二者之間的結(jié)合比為1∶1，結(jié)合常數(shù)為1368 L/mol，檢出限為21.2 μmol/L（S/N=3）。利用DFT方法對(duì)探針K1結(jié)構(gòu)和K1-Ag+可能的絡(luò)合結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分子構(gòu)型優(yōu)化， 并計(jì)算絡(luò)合物中Ag+與K1的結(jié)合能，結(jié)果表明，Ag+與兩個(gè)三氮唑環(huán)和蒽醌單元絡(luò)合結(jié)構(gòu)結(jié)合能最大，與核磁滴定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果吻合。K1和K1-Ag+的優(yōu)化結(jié)構(gòu)顯示，K1與Ag+結(jié)合后，分子的三氮唑環(huán)發(fā)生轉(zhuǎn)位， 蒽醌平面發(fā)生輕度彎曲。熒光共聚焦成像結(jié)果表明， 探針K1對(duì)Ag+有較好的選擇性和靈敏度，可實(shí)現(xiàn)人肝癌細(xì)胞（HepG2）中微量Ag+的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞?蒽醌;三氮唑;熒光探針;銀離子;熒光成像

1?引 言

銀離子（Ag+）具有殺菌、催化等特性[1，2]， 可作為抗生劑、動(dòng)植物的轉(zhuǎn)錄抑制劑、耐質(zhì)粒轉(zhuǎn)變靶標(biāo)等[3，4];同時(shí)，銀在電子產(chǎn)品、攝影、影像、制藥、醫(yī)療和生物學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。然而，這也造成了環(huán)境中的Ag+污染，威脅人類健康，引起了廣泛關(guān)注。如高濃度的Ag+可通過(guò)食物鏈在體內(nèi)累積， 對(duì)大腦、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等造成損害。另外， 由于一些含銀鹽藥物的過(guò)度及不合理使用， 也使Ag+積聚在肝臟組織，可引起肝癌等疾病[5～8]。因此， 開發(fā)快速、靈敏的Ag+的分析檢測(cè)方法具有重要意義。

目前，檢測(cè)Ag+的方法包括熒光法[9，10]、電化學(xué)法[11]、比色法[12]、原子吸收法[13]和表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）[14]等。其中熒光傳感方法具有簡(jiǎn)單、成本低、快速、高選擇性和靈敏度等特性， 廣泛用于檢測(cè)陽(yáng)離子、陰離子等[15，16]。近年來(lái)， 文獻(xiàn)報(bào)道了許多檢測(cè)重金屬離子，如Zn2+、 Pb2+和Hg2+的新型熒光探針[17，18]， 以及檢測(cè)Ag+的熒光探針， 如羅丹明、喹諾酮和BODIPY衍生物等[19，20]，然而，具有優(yōu)良性能的Ag+熒光探針仍然是目前的研究熱點(diǎn)。

蒽醌類衍生物，如阿霉素、柔紅霉素等， 具有多種藥理活性， 以及抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗病毒、抗真菌、增強(qiáng)免疫力等多種生物學(xué)和藥學(xué)特性[21]。此外， 蒽醌類衍生物具有剛性平面結(jié)構(gòu)， 并含有大環(huán)共軛體系， 具有熒光發(fā)射波長(zhǎng)適中、光穩(wěn)定性好、發(fā)光效率高的特點(diǎn)， 更主要的是其熒光和紫外吸收波長(zhǎng)均出現(xiàn)在可見光區(qū)。因此， 它還是一類重要的染料。由于可以絡(luò)合金屬離子， 氨基和羥基取代的蒽醌衍生物也被廣泛用作發(fā)色團(tuán)。近年來(lái)，蒽醌類熒光探針逐漸成為科研人員關(guān)注的熱點(diǎn)[22，23]，但蒽醌衍生物熒光探針用于Ag+檢測(cè)的研究尚未見報(bào)道。

1，2，3-三氮唑化合物是一類具有重要生物活性的五元氮雜環(huán)化合物， 多數(shù)基于三氮唑基團(tuán)的探針主要是通過(guò)三氮唑形成一個(gè)結(jié)合口袋， 當(dāng)被分析物與探針逐漸結(jié)合后， 由于熒光機(jī)制不同，如PET （光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移）、ICT （電荷轉(zhuǎn)移）等， 探針的熒光或增強(qiáng)或淬滅， 因此，三氮唑基熒光探針通常具有良好的選擇性和強(qiáng)的結(jié)合能力[24，25]。本研究以具有優(yōu)良生物學(xué)特性和光學(xué)特性的蒽醌為母體，設(shè)計(jì)合成了一類基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）可用于細(xì)胞成像的高選擇性銀離子熒光探針。利用蒽醌作為熒光團(tuán)， 以1，2，3-三氮唑?yàn)榻Y(jié)合位點(diǎn)， 通過(guò)Click反應(yīng)合成了含有不同羥烷基鏈的蒽醌衍生物K1和K2， 并利用DFT理論計(jì)算等手段研究了探針K1與Ag+的絡(luò)合結(jié)構(gòu)和光致發(fā)光的機(jī)理，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Ag+的專一性、高靈敏性檢測(cè)，并可用于生物成像檢測(cè)。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

UV-2600紫外可見分光光度計(jì) （日本島津公司）;AC400 型超導(dǎo)核磁共振儀 （TMS作內(nèi)標(biāo)，瑞士布魯克公司）;UPLC-TQD液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀 （美國(guó)沃特斯公司）;F-4500 熒光分光光度計(jì) （日本日立公司）;FV 1000激光共焦顯微鏡 （日本奧林巴斯公司）。

葡萄糖、溴己醇、溴丙醇、疊氮化鈉、五水硫酸銅、抗壞血酸鈉（北京伊諾凱科技有限公司）;三氟化硼乙醚 （分析純，百靈威科技有限公司）;1，8-二羥基蒽醌、溴丙炔 （上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司）;金屬硝酸鹽與硫酸鹽為結(jié)晶水合物。所用試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為二次亞沸蒸餾水。

2.2?熒光探針K1和K2的合成

銀離子熒光探針K1和K2的合成路線：

2.2.1?1，8-二-O-炔丙基-蒽醌2的合成[26] 將1，8-二羥基蒽醌 （2.013 g， 8.38 mmol）溶于100 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中， 加入K2CO3 （5.96 g， 42 mmol） 和3-溴-1-丙炔 （2.6 mL， 33.5 mmol）， 室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20 h后， 用二氯甲烷萃取，水洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥， 過(guò)濾并濃縮， 用柱層析 （石油醚-乙酸乙酯，4∶1，V/V） 分離得到2.330 g黃色固體1，8-二-O-炔丙基-蒽醌2， 產(chǎn)率為88%。1H NMR （400 MHz， CDCl3）： δ 7.92 （dd， J=8.0， 0.8 Hz， 2H）， 7.67 （t， J=8.0 Hz， 2H）， 7.50 （dd， J=8.4， 0.8 Hz， 2H）， 4.94 （d， J=2.4 Hz， 4H）， 2.55 （t， J=2.4 Hz， 2H）。

2.2.2?化合物 3a和3b的合成[27] 將1-溴丙醇 （2 mL， 22.3 mmol， 1.0 equiv） 溶于20 mL DMF中， 加入疊氮化鈉（4.34 g， 66.9 mmol， 3.0 equiv）， 90 oC 加熱攪拌。薄層色譜（TLC）監(jiān)測(cè)原料反應(yīng)完全后， 加入水，用二氯甲烷萃取，旋轉(zhuǎn)蒸干有機(jī)相， 柱色譜分離，得到無(wú)色油狀液體 1-疊氮基丙醇3a （2.1962 g， 97%）。采用同樣方法制得無(wú)色油狀液體 1-疊氮基己醇3b，產(chǎn)率為 85%。3a： 1H NMR （400 MHz， CDCl3） δ 3.74～3.71 （m， 2H）， 3.43 （t， J = 6.8 Hz， 2H）， 1.85～1.78 （m， 2H）。 3b： 1H NMR（400 MHz， CDCl3） δ 3.64 （t， J = 6.8 Hz， 2H）， 3.26 （t， J = 6.8 Hz， 2H）， 1.64～1.54（m， 4H）， 1.45～1.38 （m， 4H）。

2.2.3?探針K1和探針K2的合成?將1-疊氮基丙醇3a （0.40 mL， 6.08 mmol） 和1，8-二-O-炔丙基-蒽醌1（0.50 g， 1.58 mmol） 溶于H2O-THF（1∶1，V/V）混合溶劑中，加入CuSO4·5H2O（59 mg， 0.24 mmol）和L-抗壞血酸鈉鹽（90 mg， 0.48 mmol）， 避光，于55℃加熱攪拌下反應(yīng)，產(chǎn)物用二氯甲烷萃取，水洗滌， 無(wú)水Na2SO4干燥， 過(guò)濾、濃縮， 用柱色譜分離（乙酸乙酯-甲醇，10∶1，V/V） ，得到黃色固體化合物K1（150 mg， 80%）。采用同樣方法制備黃色固體化合物K2（產(chǎn)率為95%）。 Compound K1：1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δ 8.25（s， 2H）， 7.76～7.70（m， 6H）， 5.34（s， 4H）， 4.68（t， J=4.4 Hz， 2H）， 4.43（t， J=7.2 Hz， 4H）， 3.40（dd， J=10.8， 6.0 Hz， 4H）， 1.99～1.92（m， 4H）。13C NMR（150 MHz， DMSO-d6） δ 183.2， 181.1， 157.5， 142.3， 134.2， 125.0， 123.9， 120.9， 118.8， 62.5， 57.4， 46.8， 33.0。ESI（+）-HRMS（m/z）： [M+Na]+ calcd. for C26H26N6O6Na 541.1806， found 541.1802）。Compound K2： 1H NMR（400 MHz， DMSO-d6） δ 8.23（s， 2H）， 7.75～7.70（m， 6H）， 5.34（s， 4H）， 4.37～4.32（m， 6H）， 3.36～3.32（m， 4H）， 1.83～1.76（m， 4H）， 1.40～1.32（m， 4H）， 1.30～1.67（m， 8H）。13C NMR（100 MHz， DMSO）： δ 183.1， 181.0， 157.4， 142.3， 134.2， 124.6， 124.0， 121.0， 118.8， 62.6， 60.5， 49.4， 32.3， 29.8， 25.7， 24.9。ESI（+）-HRMS（m/z）： [M+Na]+ calcd. for C32H38N6O6Na 625.2745， found 625.2745）。

2.3?探針溶液的制備和檢測(cè)方法

配制濃度為1.0 × 102 mol/L的K1、K2探針DMSO儲(chǔ)備溶液、濃度為1.0 × 103 mol/L的不同陽(yáng)離子儲(chǔ)備溶液以及pH=7.4 的HEPES（10 mmol/L）緩沖溶液。測(cè)試前用HEPES緩沖溶液將上述儲(chǔ)備液稀釋到所需濃度，在5 mL比色管中分別加入600 μL DMSO、 25 μL K1標(biāo)準(zhǔn)液和適量金屬離子標(biāo)準(zhǔn)液， 用HEPES緩沖溶液定容至5 mL， 搖勻， 靜置30 min后，測(cè)量紫外-可見吸收光譜和和熒光光譜（λex=340 nmf， 激發(fā)狹縫10.0 nm， 發(fā)射狹縫20.0 nm， 儀器靈敏度為高）。

2.4?細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

將復(fù)蘇的人肝癌細(xì)胞HepG2（Human hepatoma cell line，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院）用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基， 在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)， 待其貼壁80%左右， 消化、離心、計(jì)數(shù)，接種到激光共聚焦皿中（50000個(gè)/皿）， 在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h， 待其貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用培養(yǎng)基稀釋K1溶液至50 μmol/L，與貼壁后的細(xì)胞共培養(yǎng)30 min， 接著用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，進(jìn)行共聚焦成像。另外，將細(xì)胞與50 μmol/L Ag+溶液培養(yǎng)30 min，然后用探針染色30 min ， PBS緩沖液洗滌3次后，成像分析。

3?結(jié)果與討論

3.1?探針K1和K2對(duì)金屬離子的識(shí)別

采用紫外-可見吸收光譜和熒光光譜考察了探針K1和K2對(duì)不同離子的響應(yīng)。分別測(cè)定含有探針K1（50 μmol/L）和金屬離子Ag+、Al3+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Hg2+、Fe3+、K+、Mn2+、Na+、NH+4、Ni2+、Pb2+和Zn2+（1.0 mmol/L， 20 equiv.）的HEPES-DMSO（7∶1， V/V）溶液的紫外-可見吸收光譜和熒光光譜。加入Ag+后，探針的紫外吸收峰從378 nm藍(lán)移到364 nm處。由熒光光譜可見， 未加入離子前， 探針K1在466和522 nm處的熒光峰強(qiáng)度很低;只有加入Ag+時(shí)的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)， 而其它金屬離子的加入對(duì)探針K1的熒光強(qiáng)度幾乎沒有影響，說(shuō)明探針K1對(duì)Ag+具有選擇性識(shí)別的特性。探針K2對(duì)不同離子的響應(yīng)，只有加入Ag+時(shí)，K2熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，但增強(qiáng)程度不及K1顯著，表明含羥基的長(zhǎng)烷基鏈可降低Ag+的響應(yīng)。因此， 選擇化合物K1作為Ag+熒光探針，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2?共存離子對(duì)探針K1識(shí)別Ag+的熒光強(qiáng)度的影響

為了進(jìn)一步確認(rèn)探針K1對(duì)Ag+的選擇識(shí)別作用， 采用常見的金屬陽(yáng)離子作為干擾物， 研究了探針K1對(duì)Ag+的選擇性識(shí)別能力及抗干擾能力。向探針K1溶液（50 μmol/L）中分別加入濃度為1.0 mmol/L的金屬離子Ag+、Al3+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Hg2+、Fe3+、K+、Mn2+、Na+、NH+4、Ni2+、Pb2+和Zn2+， 搖勻后靜置10 min， 測(cè)量466 nm處熒光強(qiáng)度;再分別加入濃度為1.0 mmol/L 的Ag+， 其濃度比為C（K1） ∶ C（Ag+） ∶ C（干擾離子）=1 ∶ 20 ∶ 20， 測(cè)量466 nm處熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，共存的干擾離子的熒光強(qiáng)度與Ag+單獨(dú)存在時(shí)相差很小，其它共存離子對(duì)Ag+的識(shí)別也未明顯受到干擾離子的影響（其它常見陰離子、有機(jī)小分子和生物大分子的干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果見電子版文后支持信息S12）。上述結(jié)果表明，探針K1對(duì)Ag+具有良好的選擇性和抗干擾性。

3.3?不同濃度的Ag+對(duì)K1熒光光譜的影響

通過(guò)熒光滴定實(shí)驗(yàn)研究探針K1對(duì)Ag+的響應(yīng)情況。隨著溶液中Ag+濃度逐步加大， K1在466和520 nm處的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)， 466 nm處熒光強(qiáng)度變化尤其明顯，表明K1可作為開關(guān)型熒光探針檢測(cè)Ag+。Ag+濃度與熒光強(qiáng)度的工作曲線， 在0.05～0.50 mmol/L（1.0～10 equiv.）濃度范圍內(nèi)， 探針 K1 在466 nm處的熒光強(qiáng)度值與Ag+濃度呈良好的線性關(guān)系， 線性相關(guān)系數(shù)為0.9970，檢出限為21.2 μmol/L[28]。

配制了一系列探針K1與Ag+總濃度為0.25 mmol/L， 濃度比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的溶液， 測(cè)定其在λem=466 nm處的熒光強(qiáng)度，Job 's Plot曲線， 當(dāng)探針K1與Ag+濃度比為1∶1時(shí)， 熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，表明探針K1與Ag+的結(jié)合比為1∶1。隨著Ag+的加入，探針K1在466 nm處的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)， 依據(jù)熒光滴定曲線數(shù)值，利用Benesi-Hildebrand方程[23～25]得到其絡(luò)合常數(shù)， 公式如下：

其中，F(xiàn)min為探針不加Ag+時(shí)的熒光強(qiáng)度， Fmax為加入Ag+后探針最大熒光強(qiáng)度， F為加入不同濃度Ag+時(shí)探針的熒光強(qiáng)度， [Ag+]表示Ag+的濃度。依據(jù)滴定曲線的數(shù)據(jù)，以1/[[Ag+]（Fmax-Fmin）]為橫坐標(biāo)， 1/（F-Fmin）為縱坐標(biāo)得到相應(yīng)的點(diǎn)， 線性擬合得到線性方程y=7.31 × 104/Ka + 0.003（R2=0.978）， 根據(jù)上述方程可計(jì)算得結(jié)合常數(shù)為 Ka=1368 L/mol。

3.4?pH值對(duì)探針識(shí)別Ag+的影響

考察了體系pH值對(duì)探針K1在466 nm處熒光強(qiáng)度的影響。 在pH 5.0～11.0范圍內(nèi)沒有變化，探針K1在466 nm處熒光強(qiáng)度變化很小。加入10倍當(dāng)量Ag+后，在pH 6.0～9.0范圍時(shí)， 探針熒光強(qiáng)度變化較小。選擇在pH=7.4的HEPES緩沖溶液中進(jìn)行探針的離子選擇性、競(jìng)爭(zhēng)性、濃度滴定實(shí)驗(yàn)。探針檢測(cè)Ag+的熒光響應(yīng)隨時(shí)間的變化，探針K1與Ag+的結(jié)合在4 min內(nèi)即可達(dá)到平衡， 表明探針K1可快速檢測(cè)Ag+。

3.5?核磁滴定與DFT分析

探針K1與Ag+的核磁滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究了探針分子K1中Ha-Hi的化學(xué)位移的變化情況， 隨著Ag+的加入， Hg的化學(xué)位移保持不變， Ha、Hb、Hc整體向高場(chǎng)移動(dòng)0.006 ppm， Hd向高場(chǎng)移動(dòng)了0.035 ppm， He、Hf和Hi分別向低場(chǎng)移動(dòng)0.055、0.010和0.021 ppm。上述結(jié)果表明，Ag+可能與兩個(gè)三氮唑環(huán)、蒽醌單元及烷基鏈的羥基絡(luò)合[23，29]。

Ag+可與蒽醌上的羰基O、三氮唑上的N、烷基鏈上的O配位。為了進(jìn)一步探究探針K1-Ag+的絡(luò)合模式，利用密度泛函理論（DFT），在B3LYP/6-31G（d）/SDD（Ag）計(jì)算水平下，對(duì)探針K1結(jié)構(gòu)和K1-Ag+可能的4種絡(luò)合結(jié)構(gòu)-Ag（a～d）進(jìn)行了分子構(gòu)型優(yōu)化，給出部分結(jié)構(gòu)參數(shù)。AgO和AgN鍵長(zhǎng)為2.12～2.53 ， 屬于正常成鍵范圍。對(duì)絡(luò)合物中Ag+的結(jié)合能進(jìn)行了計(jì)算， 結(jié)果表明，Ag+與2個(gè)三氮唑環(huán)和蒽醌單元絡(luò)合結(jié)構(gòu)的結(jié)合能最大（119.08 kcal/mol）（表1）， 這與核磁滴定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相同。探針K1和結(jié)合能最大的K1-Ag結(jié)構(gòu)。探針與Ag+絡(luò)合后， 探針分子的三氮唑環(huán)發(fā)生轉(zhuǎn)位， 蒽醌平面發(fā)生輕度彎曲。進(jìn)一步通過(guò)含時(shí)密度泛函理論（TDDFT）在ωB97XD/6-31+G（d）/SDD（Ag）水平下對(duì)它們的紫外光譜進(jìn)行模擬， 結(jié)果表明，加入Ag+后， 探針K1在370 nm處的紫外吸收峰發(fā)生了藍(lán)移，此模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符， 說(shuō)明本研究采用的泛函和基組在光譜模擬上是可靠的。根據(jù)以上數(shù)據(jù)， 結(jié)合文獻(xiàn)[23，29]， 推測(cè)與Ag+的結(jié)合方式。所有計(jì)算由 Gaussian09 軟件包[30]運(yùn)行。

從測(cè)得的光譜數(shù)據(jù)可以推測(cè)， 與Ag配位后形成的K1-Ag具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm時(shí)， 探針K1的熒光很弱， 而加入Ag+后， 熒光迅速增強(qiáng)， 原因可能是兩條含有羥基的烷基鏈在激發(fā)態(tài)自由旋轉(zhuǎn)較強(qiáng)， 加入Ag+后， 蒽醌上的O原子和三氮唑上的N原子同時(shí)與Ag螯合， 抑制分子旋轉(zhuǎn)， 使能量損失降低， 因此熒光顯著增強(qiáng)，對(duì)Ag+具有選擇性識(shí)別。分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）是對(duì)Ag+有離子選擇性的基礎(chǔ)，K1的吸收峰藍(lán)移可以歸因于ICT， Ag+與蒽醌環(huán)上的羰基及三唑環(huán)上的氮原子結(jié)合， 產(chǎn)生的螯合熒光增強(qiáng)（CHEF）效應(yīng)也有利于Ag的識(shí)別和K1-Ag的穩(wěn)定[18，19]。

3.6?探針檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)Ag+測(cè)試了探針K1對(duì)人體肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)濃度達(dá)到10 μmol/L時(shí)， 細(xì)胞活性仍超過(guò)85%，說(shuō)明探針K1的細(xì)胞毒性較低，可用于活體細(xì)胞內(nèi)的實(shí)驗(yàn)。

為評(píng)價(jià)探針K1在活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)Ag+的能力，將探針用于HepG2的激共聚焦熒光成像。使用FV 1000激光共焦顯微鏡觀察共焦熒光成像， 在探針K1的細(xì)胞成像中， 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)未加入Ag+時(shí)， 探針K1 的熒光信號(hào)相對(duì)較弱;當(dāng)細(xì)胞加入Ag+孵育后，再加入探針K1染色， 探針K1 在兩個(gè)波段的熒光信號(hào)都明顯增強(qiáng)， 能夠明顯觀察到加入Ag+后HepG2細(xì)胞的熒光成像。

4?結(jié) 論

設(shè)計(jì)合成了兩個(gè)基于蒽醌的具有不同長(zhǎng)度烷基鏈的新型Ag+熒光探針K1和K2，基于ICT和CHEF絡(luò)合機(jī)理實(shí)現(xiàn)對(duì)Ag+的識(shí)別。探針含羥基的烷基鏈的長(zhǎng)度對(duì)識(shí)別有影響，烷基鏈長(zhǎng)度太長(zhǎng)， 如含有6個(gè)碳的K2，其響應(yīng)能力下降。探針K1與Ag+結(jié)合后熒光強(qiáng)度隨Ag+濃度增加而逐漸增強(qiáng)。光譜分析表明，探針K1對(duì)Ag+具有較好的選擇性和靈敏度， 在0.05～0.50 mmol/L濃度范圍內(nèi)，探針熒光強(qiáng)度與Ag+濃度呈較好的線性關(guān)系， 且在人肝癌細(xì)胞（HepG2）內(nèi)成功實(shí)現(xiàn)了Ag+的成像。通過(guò)核磁滴定和DFT計(jì)算， 推測(cè)其絡(luò)合機(jī)理為： Ag+與蒽醌環(huán)上的羰基及三唑環(huán)上的氮相結(jié)合，使得兩個(gè)三氮唑環(huán)翻轉(zhuǎn)，且蒽醌平面輕度彎曲，導(dǎo)致探針K1的光譜變化及對(duì)Ag的識(shí)別作用。本研究對(duì)檢測(cè)實(shí)際環(huán)境生物樣品中的Ag+具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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