曲小露 施振旦 李輝

摘要：目前，進行體外研究的卵泡顆粒細胞主要通過抽取卵泡液的方式獲得。而筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，通過該方式獲得的顆粒細胞貼壁率低且活力差。為解決該問題，在抽取方式的基礎上采用FICOLL-Paque分離液對細胞進行進一步純化，并通過CCK-8、Western Blot、免疫熒光染色、QRT-PCR、ELISA等方法分別對純化細胞的形態(tài)、增殖能力、激素分泌相關受體（FSHR、LHCGR）和基因（CYP19A1、CYP11A1、StAR）的表達及激素分泌情況進行檢測。結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)純化的細胞貼壁能力、細胞形態(tài)和增殖能力明顯改善，且各激素分泌相關基因都有表達;E2分泌量明顯提高，而P4分泌明顯降低。研究結果表明，經(jīng)FICOLL-Paque分離液純化后的豬卵泡顆粒細胞中黃體化的顆粒細胞被大部分清除，純化后的細胞活力更好且更能體現(xiàn)出顆粒細胞的特性。

關鍵詞：顆粒細胞;FICOLL-Paque;細胞增殖;孕酮;免疫熒光染色;FSH受體

中圖分類號： S828.3 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）23-0190-05

顆粒細胞存在于卵泡中，處于膜細胞與卵子之間，具有將膜細胞所合成的雄激素轉化成維持卵子發(fā)育和發(fā)情所必需的雌激素的功能，同時組成了維持卵子發(fā)育的良好微環(huán)境[1-3]，并且可通過微絨毛為卵母細胞提供營養(yǎng)支持。因此，顆粒細胞功能不良將直接影響卵子的發(fā)育潛能，并必將抑制動物的繁殖性能。前人研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細胞的凋亡可導致卵泡閉鎖[4]，而其功能受損將抑制其雌激素的分泌[5]。因此顆粒細胞是研究卵泡發(fā)育及內分泌的重要細胞模型。

目前，科研中用到的顆粒細胞普遍采用體外分離培養(yǎng)的方式獲得[6]，而體外分離培養(yǎng)的細胞狀態(tài)將直接影響后續(xù)試驗及其結果的可靠性。因此，獲得活力好的豬顆粒細胞對研究豬繁殖內分泌的調控機制具有重要意義。顆粒細胞的體外分離培養(yǎng)方法目前主要有剖切刮取和針頭抽吸分離2種，而后者的應用更為普遍，該方法操作簡便，主要通過短時間沉淀，棄去大的細胞團塊、組織塊和卵丘卵母細胞復合體（cumulus oocyte complexes，簡稱COC）后，經(jīng)離心-清洗等步驟獲得相對純凈的顆粒細胞。閆益波等研究發(fā)現(xiàn)，剖切法和抽吸法分離豬卵巢顆粒細胞的方式各有優(yōu)劣，其中抽吸法能夠更快速獲得豬顆粒細胞[7]。除上述方法外，也有研究者通過FICOLL-Paque分離液進行了人顆粒細胞的分離并進行相關試驗檢測，如Chilvers等在2012年用PERCOLL和FICOLL-Paque分離液分別進行了人顆粒細胞的分離，通過比較發(fā)現(xiàn)采用FICOLL-Paque分離液分離的顆粒細胞純度好于PERCOLL[8]。目前，尚未有采用FICOLL-Paque分離液對豬顆粒細胞進行分離純化的相關報道。

在前期大量試驗中發(fā)現(xiàn)，雖然抽吸法可以快速獲得大量顆粒細胞，但是獲得的細胞性能不穩(wěn)定，主要表現(xiàn)在細胞貼壁數(shù)量少、活力差等方面。為解決該問題，本試驗擬在抽吸法的基礎上，進一步采用FICOLL-Paque分離液以密度梯度離心的方式對通過抽吸卵泡液獲得的細胞進行純化，旨在獲得更加純凈、活力更好的豬卵泡顆粒細胞，為后續(xù)的試驗開展提供更好的細胞模型。

1 材料與方法

本試驗于2018年5—7月在江蘇省農業(yè)科學院畜牧研究所動物品種改良與繁育重點實驗室進行。

1.1 材料

豬卵巢取自江蘇省南京市當?shù)赝涝讏?80日齡左右的健康商品母豬。收集卵泡發(fā)育好的卵巢，置于37 ℃盛有含2%青鏈霉素的生理鹽水的保溫杯中，于2 h內帶回實驗室。

FICOLL-Paque分離液購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，細胞總RNA提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司，酶聯(lián)免疫法測雌二醇、孕酮檢測試劑盒購自北京北方生物技術研究所有限公司，反轉錄相關試劑購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司，青鏈霉素、DNA提取試劑盒、0.25%無EDTA胰酶購自北京全式金生物科技有限公司，熒光定量PCR試劑、FITC標記羊抗兔二抗購自上海翊圣生物科技有限公司，抗FSHR和抗LHCGR抗體購自愛必信（上海）生物科技有限公司，CCK-8、蛋白裂解液、BCA法測蛋白、羊抗兔HRP標記二抗購自碧云天生物技術有限公司，DMEM/F12、PBS購自南京維森特生物技術有限公司，胎牛血清購自Gibico。陰性對照細胞3D4/21豬肺泡巨噬細胞由筆者所在實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 豬卵泡顆粒細胞的分離與培養(yǎng) 用37 ℃無菌生理鹽水沖洗卵巢3～4次后，用滅菌紗布拭干卵巢表面水分，選取直徑為3～6 mm 的卵泡，用10 mL注射器配10號針頭抽取卵泡液（注意避開血管）。

傳統(tǒng)分離方法：將上述操作收集的卵泡液在 37 ℃ 條件下水浴靜置5 min，收集上清分裝到15 mL離心管中，于 1 200 r/min 離心機中離心2 min。棄掉上清，將收集到的細胞用PBS重懸清洗2～3次，用含10% FBS，2%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，用臺盼藍染色計數(shù)后調整細胞密度至1×106個/mL，并置于溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的條件下培養(yǎng)。

FICOLL-Paque分離方法：將收集的卵泡液裝入15 mL離心管中，在37 ℃條件下水浴靜置15 min，棄上清后，于 1 200 r/min 離心機中離心2 min。棄掉上清，將沉淀重懸后轉移至裝有FICOLL-Paque分離液中的15 mL離心管中（輕輕沿管壁滴加至FICOLL-Paque分離液上層，注意不要打破液面）。輕輕轉移至水平轉子離心機中，在4 000 r/min下離心 30 min。待細胞分層后，將中層懸浮層細胞吸出轉移至新的15 mL無菌離心管中，于1 200 r/min下離心2 min，去除FICOLL-Paque分離液后，加入不含EDTA的0.25%胰酶消化2 min，使細胞團分散成單個細胞。用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，然后在1 200 r/min下離心5 min，將收集的細胞用PBS清洗2～3次后，用含10% FBS、2%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，用臺盼藍染色計數(shù)后調整細胞密度至1×106個/mL，并置于溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的條件下培養(yǎng)。

2.3 與激素分泌相關基因的表達檢測

顆粒細胞是激素分泌的關鍵細胞。在卵泡期，膜細胞合成的雄激素主要在FSH作用下轉變?yōu)榇萍に?，在此過程中FSHR和CYP19A1發(fā)揮重要作用。LH峰后排卵，同時顆粒細胞開始黃體化，逐步減少雌激素分泌，轉而分泌孕酮。在此期間，LHCGR接受到LH的信號后，將合成孕酮的原料膽固醇在StAR的協(xié)助下從線粒體外膜轉移至內膜，并在CYP11A1和HSD-3β的作用下加工成孕酮。因此，為滿足孕酮的分泌，顆粒細胞必須表達LHCGR、StAR和CYP11A1等基因。此外，顆粒細胞又分為壁顆粒細胞和卵丘細胞。因卵丘細胞不表達LHCGR，不能接受LH的信號[11]，所以，在體外試驗中常做區(qū)分。在本研究中，為檢測所分離的細胞的確是壁顆粒細胞，對FSHR、LHCGR、StAR、CYP19A1、CYP11A1基因進行了檢測。從圖3-A可以看出，采用FICOLL-Paque方法和傳統(tǒng)方法分離的細胞均表達了上述各基因（CT值均在30以下），而作為空白對照的豬肺泡巨噬細胞3D4/21中各基因擴增的CT值均在34以上，可視為不表達。同時對采用傳統(tǒng)方法和FICOLL-Paque方法分離的顆粒細胞中上述各基因的表達進行了電泳分析（圖3-B）。為證明所分離的細胞在蛋白水平上表達了FSHR，采取免疫熒光染色的方法對FSHR在細胞中的表達進行了檢測，結果發(fā)現(xiàn)，2種方法所分離的細胞均表達了FSHR（圖3-C）。另外進一步通過Western blot的方法檢測與激素分泌相關的基因的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，相對于豬肺泡巨噬細胞3D4/21，F(xiàn)ICOLL-Paque方法分離的顆粒細胞在蛋白水平全部表達（圖3-D）。

2.5 雌激素和孕酮分泌的檢測

顆粒細胞的最主要功能是激素的分泌。卵泡期顆粒細胞主要分泌雌激素，而黃體化的顆粒細胞停止雌激素分泌，轉而分泌孕酮。因此，可通過檢測細胞培養(yǎng)液中雌激素和孕酮的分泌水平來判定細胞的狀態(tài)。本研究采用ELISA分析了2種分離方法所分離的顆粒細胞培養(yǎng)液中24 h內的激素累積量，并通過DNA的量進行均一化處理。結果發(fā)現(xiàn)，采用FICOLL-Paque法分離的細胞單位雌二醇分泌量高于傳統(tǒng)方法;相反孕酮的分泌量明顯低于傳統(tǒng)方法（圖4）。從該結果可以看出，傳統(tǒng)方法分離的顆粒細胞中含有部分已經(jīng)黃體化的細胞，而經(jīng)FICOLL-Paque方法純化后，可明顯清除該部分細胞。

3 討論

顆粒細胞是研究卵巢類固醇激素生成和卵泡發(fā)育時最常用的一種細胞，在雌二醇、孕酮的生成和卵子的發(fā)育中起到重

要作用。隨著卵泡的發(fā)育，顆粒細胞的形態(tài)和功能發(fā)生改變[12]。鄰近排卵期時，顆粒細胞會慢慢黃體化，大量分泌孕酮，停止或者少量分泌雌二醇[13-14]。為了研究與顆粒細胞雌二醇分泌相關的調控機制， 需用到雌二醇分泌高峰期的顆粒細胞，然而在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，采用傳統(tǒng)分離方法獲得的細胞并不能滿足試驗的需求。因此需要優(yōu)化分離方法，為顆粒細胞的體外研究提供更好的細胞模型。

本研究在傳統(tǒng)分離方法的基礎上，采用FICOLL-Paque分離液進一步純化的方式分離豬卵泡顆粒細胞。FICOLL-Paque分離液是高分子量蔗糖聚合物和泛影酸鈉混合溶液，作為密度梯度介質可通過簡單快速離心程序從血液中有效提取高純度的活單核細胞，此前已有多篇成功分離單核巨噬細胞的報道[15-17]，有關學者嘗試用其分離人顆粒細胞[18-19]，并取得了較好的效果。本研究率先將該方法應用于豬顆粒細胞的分離，結果發(fā)現(xiàn)，通過該方法分離的細胞不但貼壁率大大提高，而且細胞狀態(tài)優(yōu)于傳統(tǒng)方法。另外，進一步采用CCK-8方法對細胞的活力進行檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)FICOLL-Paque分離液純化過的細胞增殖能力明顯強于普通方法所分離的細胞。雖然都表達了與激素分泌相關的基因，但是進一步的激素測定結果顯示，經(jīng)FICOLL-Paque分離液純化過的細胞單位孕酮分泌量明顯低于傳統(tǒng)方法分離的細胞，但是雌激素的分泌量卻相反。因此該結果從側面證實有些豬卵巢顆粒細胞已經(jīng)開始黃體化，而經(jīng)FICOLL-Paque分離后可清除該部分細胞。相關報道認為，在抽吸的卵泡液中殘留有一定數(shù)量的紅細胞和白細胞[9-10]。因此，除了細胞自身黃體化的原因外，卵泡液中的殘留物也可能是影響所分離的顆粒細胞狀態(tài)和活力的重要因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)分離方法所獲得的細胞多為單細胞，而其中貼壁好且活力好的細胞多為細胞團;相反經(jīng)FICOLL-Paque方法分離的細胞中細胞團居多，這也是在實際操作中進行胰酶消化的原因。這種現(xiàn)象提示，卵泡中顆粒細胞功能的維持可能需要細胞間的互作和連接。黃明宇等認為，細胞間互作可以控制細胞存活、凋亡、遷移、增殖和分化等基本細胞功能[20]，而細胞間互作可通過細胞外基質（extracellular matrix，簡稱ECM）以及旁分泌、自分泌和直接的細胞-細胞接觸實現(xiàn)[21]。直接的細胞間接觸是由間隙連接、小蛋白質隧道組成[22]。間隙連接通信是細胞培養(yǎng)中細胞通信的重要組成部分，它由連接蛋白、小質膜蛋白組成，它們形成蛋白質隧道，形成連接2個相鄰細胞的間隙連接[23]。前人研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細胞在卵泡期的信號和物質共享需要胞間連接分子CX43的參與，而黃體化后ECM可發(fā)生重構，同時胞間連接也會削弱[24-25]。本試驗通過FICOLL-Paque方法分離的細胞多以細胞團的形式存在，該現(xiàn)象也恰好說明分離的細胞間互作強;而傳統(tǒng)方法獲得的細胞多以單細胞形式存在，說明通過這種方式分離的細胞，由于接近黃體化，而導致細胞間的互作差。然而目前產(chǎn)生此種現(xiàn)象的分子機制尚未明晰，還需今后進一步開展這方面的研究。

本研究在傳統(tǒng)方法基礎上，采用FICOLL-Paque分離液成功分離到了較純的豬卵泡顆粒細胞，并通過試驗進一步證明了通過該方法分離的細胞貼壁率、增殖能力要優(yōu)于傳統(tǒng)方法，為今后的試驗提供了較好的細胞模型。

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收稿日期：2018-08-16

基金項目：國家自然科學基金（編號：31402080）;江蘇省自然科學基金（編號：BK20151365）。

作者簡介：曲小露（1993—），男，山東東營人，碩士研究生，主要從事動物繁殖方面研究。E-mail：qquuxxiiaaoolluu@163.com。

通信作者：李 輝，博士，副研究員，主要從事動物繁殖方面研究。E-mail：lhlydk@126.com。