湯中文 倪正義

(武漢市金銀潭醫(yī)院胸外科，湖北 武漢 430023)

2015年我國肺癌新發(fā)病例約73.3萬，死亡61.0萬，且呈快速增長趨勢〔1〕，肺腺癌屬于非小細胞肺癌，是肺癌主要的病理類型，其細胞惡性程度強，血行轉移發(fā)生早，多數(shù)患者就診時已處于晚期〔2〕。表皮生長因子受體(EGFR)是影響肺腺癌進展的重要因素，EGFR突變的肺腺癌細胞傾向于更高的惡性程度，同時存在EGFR突變的患者腫瘤進展更快且預后不良〔3〕，表明EGFR可作為原癌基因參與促進肺腺癌的進展。厄洛替尼為表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)，可顯著改善EGFR突變肺腺癌患者病情及預后水平，是目前晚期肺腺癌患者靶向治療的一線藥物之一〔4〕，然而原發(fā)及獲得性耐藥的發(fā)生將最終導致厄洛替尼治療的失敗〔5〕。漿細胞瘤轉化遷移基因(PVT)1屬于長鏈非編碼RNA(LncRNA)，是近年腫瘤研究的熱點分子，其可通過多種途徑參與促進不同惡性腫瘤的惡性行為〔6〕。本實驗以EGFR敏感突變的PC9肺腺癌細胞系為模型，對PVT1與厄洛替尼抵抗的關系及相關機制進行初步探究。

1 材料與方法

1.1實驗細胞及試劑 實驗細胞包括人肺腺癌細胞系PC9(上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司)及人胚腎細胞293T(美國模式培養(yǎng)物集存庫)。主要實驗試劑包括：科研用鹽酸厄洛替尼(美國Selleck公司，貨號：S1023)，DMEM高糖培養(yǎng)基及胎牛血清(美國Gibco公司)，胰蛋白酶-EDTA消化液(上海索寶生物科技有限公司)，嘌呤霉素(美國Sigma公司)，慢病毒包裝試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，慢病毒對照載體、干擾載體siPVT1-1及siPVT1-2(蘇州吉瑪基因股份有限公司)，TRIzol Reagent RNA提取試劑(美國Invitrogen公司)，反轉錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ核酸熒光染料(大連寶生物工程有限公司)，qPCR引物合成(武漢金開瑞生物工程有限公司)，Ripa蛋白裂解液及BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，蛋白酶抑制劑cocktail(美國Roche公司)，EasyBlot電化學發(fā)光(ECL)顯色試劑盒(上海生工生物工程公司)，抗體(美國Abcam公司)：CD133(ab19898)，CD44(ab51037)，β-actin(ab8227)，Goat Anti-Rabbit免疫球蛋白(Ig)G二抗(ab6721)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)。

1.2實驗儀器 主要實驗儀器包括：HeraguardTMECO超凈工作臺及Forma CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)，DM1000顯微鏡(德國Leica公司)，1-16K高速離心機(德國Sigma公司)，2720 Thermal Cycler PCR儀及Nanodrop2000超微量分光光度計(美國Thermo Scientific公司)，7500 Fast實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Scientific公司)，iMark多功能酶標儀(美國Bio-Rad公司)，電泳儀及轉膜儀等(上海天能科技有限公司)，Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)(美國Thermo Scientific公司)。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng)與分組處理 PC9及293T細胞均使用10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境：5%CO2，37℃，濕度100%。分組處理：將293T細胞接種至6孔板中，接種濃度為2×105個/孔，共接種3孔，分別標記為對照組、干擾A組及干擾B組病毒，培養(yǎng)過夜后取3支1.5 ml離心管，每管加入7.5 μl轉染脂質體及500 μl DMEM高糖培養(yǎng)基，并分別加入慢病毒對照載體、干擾載體siPVT1-1及siPVT1-2，充分混勻后室溫靜置20 min，分別加入相應的293T細胞中，6 h后更換10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后收集細胞上清液，過濾后得到3組病毒懸液備用。將PC9細胞接種至6孔板中，接種濃度為2×105個/孔，共接種3孔，同樣分別標記為對照組，干擾A組及干擾B組，將各組病毒懸液與10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基1∶1混合培養(yǎng)各組PC9細胞3天，1 μg/ml嘌呤霉素篩選細胞至穩(wěn)定生長。

1.3.2實時熒光定量PCR(qPCR)檢測各組細胞PVT1、CD133和CD44 mRNA表達水平 收集對照組、干擾A組及干擾B組細胞2×105個以上，Trizol法提取細胞總RNA，反轉錄試劑盒得到3組細胞的cDNA模板，稀釋合成引物，引物序列：PVT1上游引物5′-CATCCGGCGCTCAGCT-3′，下游引物5′-TCATGATGGCTGTATGTGCCA-3′；CD133上游引物5′-TTACGGCACTCTTCACCT-3′，下游引物5′-TATTCCACAAGCAGCAAA-3′；CD44上游引物5′-ACAACTGGTGATGGAGACTCATCC-3′，下游引物5′-CAGAGTGGCTTATCATCTTGG-3′；β-actin上游引物5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′，下游引物5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′。根據(jù)SYBR Premix Ex Taq Ⅱ核酸熒光染料要求配置qPCR體系，行兩步法PCR擴增：預變性95℃，30 s；擴增反應95℃，5 s，60℃，34 s，熔解階段95℃，15 s。以β-actin為內參基因，2-△△CT法計算各組細胞PVT1及CD133、CD44 mRNA的表達量。

1.3.3Western印跡檢測各組細胞CD133和CD44 蛋白表達水平 收集對照組、干擾A組及干擾B組細胞5×105個以上，Ripa裂解液冰上裂解細胞2 h，13 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，取50 μg配置十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上樣體系，100℃變性5 min，10%SDS-PAGE電泳穩(wěn)壓120 V，2 h，轉膜穩(wěn)流300 mA，2 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，PBS洗膜后一抗4℃搖轉孵育過夜，抗體濃度1∶1 000，PBS洗膜3次，1∶2 000二抗室溫孵育2 h，PBS洗膜3次后行ECL發(fā)光，Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)曝光條帶上蛋白印跡，并掃描灰度值，以β-actin為內參基因，目的條帶與β-actin灰度值比作為目的蛋白表達量。

1.3.4CCK-8實驗檢測各組細胞厄洛替尼半抑制濃度(IC50) 接種對照組、干擾A組及干擾B組細胞于96孔板中，濃度2 000個/孔，設置0、2.5、5、10、20、40、80、160、320 nmol/L厄洛替尼濃度梯度，每組濃度梯度設置5個重復孔，培養(yǎng)過夜后加入相應濃度的厄洛替尼繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄上清，CCK-8試劑與10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基1∶5混合均勻后加入細胞中，37℃孵育1 h，酶標儀檢測450 nm處波長，以各組細胞0 nmol/L濃度的吸光值為基線繪制擬合曲線，并分析細胞厄洛替尼IC50值。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q法。

2 結 果

2.1各組細胞PVT1、CD133和CD44 mRNA表達水平的比較 對照組、干擾A組及干擾B組細胞PVT1表達水平分別為(0.057±0.006)、(0.016±0.002)及(0.012±0.002)；對照組、干擾A組及干擾B組細胞CD133 mRNA表達水平分別為(0.237±0.019)、(0.095±0.010)及(0.127±0.014)；對照組、干擾A組及干擾B組細胞CD44 mRNA表達水平分別為(0.386±0.033)、(0.179±0.013)及(0.142±0.018)，干擾A組及干擾B組PVT1、CD133和CD44 mRNA的表達水平均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2各組細胞CD133及CD44蛋白表達水平的比較 對照組、干擾A組及干擾B組細胞CD133 蛋白表達水平分別為(0.691±0.103)、(0.348±0.072)及(0.316±0.085)；對照組、干擾A組及干擾B組細胞CD44 蛋白表達水平分別為(0.540±0.093)、(0.274±0.060)及(0.282±0.057)；干擾A組及干擾B組CD133和CD44 蛋白表達水平均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 對照組、干擾A組及干擾B組細胞CD133及CD44 蛋白表達水平

2.3各組細胞厄洛替尼IC50的比較 對照組、干擾A組及干擾B組細胞厄洛替尼IC50分別為〔(149.4±15.3)nmol/L〕、〔(53.1±8.2)nmol/L〕及〔(67.4±10.5)nmol/L〕，干擾A組及干擾B組厄洛替尼IC50顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

LncRNA是一類無開放閱讀框且轉錄本長度大于200 nt的RNA分子，其不翻譯相應蛋白，而是通過轉錄調控及轉錄后調控等表觀遺傳機制發(fā)揮生物學作用〔7〕?；诒碛^遺傳在腫瘤中的重要地位，包括PVT1在內的多種LncRNA被發(fā)現(xiàn)參與影響惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔8〕，PVT1基因定位于人染色體8q24上，研究顯示其在多種惡性腫瘤組織中表達上調，且可促進腫瘤細胞的惡性行為及化療抵抗的形成：PVT1被發(fā)現(xiàn)高表達于胰腺癌，且表達與患者淋巴結轉移及不良預后正相關，PVT1是導致胰腺癌患者預后不良的獨立危險因素〔9〕；PVT1在胃癌組織及細胞中表達上調，與患者預后不良正相關，且在多藥耐藥的胃癌組織及細胞中表達進一步增強，體外研究顯示PVT1可促進多藥耐藥基因、mTOR信號通路及缺氧誘導因子1α的活化介導胃癌細胞的惡性行為〔10〕；PVT1高表達于卵巢癌組織中，且可通過抑制卵巢癌細胞的凋亡介導其順鉑抵抗能力的形成〔11〕；PVT1還可通過調控信號轉導與轉錄激活因子(STAT)6的表達促進乳腺癌細胞的體內外增殖〔12〕；PVT1在結直腸癌組織中表達上調，同樣可提示患者預后不良，體外siRNA介導PVT1表達下調后細胞增殖及轉移能力均顯著下調〔13〕；非小細胞肺癌組織及細胞中同樣發(fā)現(xiàn)PVT1的高表達，且PVT1表達與細胞組織學分級、淋巴結轉移及患者不良預后顯著正相關，體外干擾PVT1表達可下調肺癌細胞增殖轉移能力，提示PVT1對肺癌細胞惡性行為存在促進作用〔14，15〕，但目前有關PVT1與肺腺癌厄洛替尼抵抗的關系及相關機制尚不明確。腫瘤干細胞是一類具有自我更新及多向分化潛能的腫瘤細胞，其具有啟動和重建腫瘤組織表型的能力，被認為與惡性腫瘤放化療抵抗的形成密切相關〔16〕，CD133及CD44是經(jīng)典的非小細胞肺癌干細胞標志物，CD133參與腫瘤信號轉導及免疫逃逸等機制，是影響腫瘤細胞生長及生存的重要分子，而CD44則參與細胞間及細胞間質間的特異性粘連，對腫瘤細胞的黏附及上皮間充質轉化具有重要意義，兩者均被發(fā)現(xiàn)參與肺癌細胞放化療抵抗的形成〔17，18〕。另外，F(xiàn)arhana等〔19〕在研究中指出PVT1與結直腸癌細胞干細胞特性存在密切聯(lián)系。

本研究結果顯示，體外干擾PC9肺腺癌細胞系中PVT1表達后，細胞CD133及CD44的mRNA及蛋白表達均出現(xiàn)明顯下調，提示PVT1可能通過CD133及CD44轉錄水平的正調控作用，促進肺腺癌的干細胞特性。干擾PVT1表達后，細胞厄洛替尼IC50值顯著降低，對厄洛替尼的敏感性增強，提示PVT1對PC9細胞厄洛替尼抵抗發(fā)生的促進作用。綜上所述，本研究表明PVT1可通過介導肺腺癌細胞干細胞特性促進其厄洛替尼抵抗的發(fā)生。