谷 蕾，呂喜英

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放化療科）

厄洛替尼聯(lián)合survivin siRNA對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549增殖的影響

谷 蕾1，呂喜英2△

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院放化療科）

目的:探討厄洛替尼聯(lián)合survivin siRNA對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549的作用。方法:survivin siRNA轉(zhuǎn)染、厄洛替尼單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用于人肺腺癌細(xì)胞A549，應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT）比色法觀察對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用，免疫組化染色法觀察A549細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:survivin siRNA轉(zhuǎn)染聯(lián)合厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且可明顯降低A549細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)，與單獨(dú)應(yīng)用survivin siRNA轉(zhuǎn)染和厄洛替尼比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）。結(jié)論:應(yīng)用siRNA沉默survivin表達(dá)可提高人肺腺癌細(xì)胞A549對(duì)厄洛替尼的敏感性。

厄洛替尼；survivin siRNA；人肺腺癌A549細(xì)胞

Survivin表達(dá)于包括肺癌在內(nèi)的幾乎所有惡性腫瘤組織中。厄洛替尼(Erlotinib)為口服的I型人表皮生長(zhǎng)因子受體(HER1/EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI），用于化療方案失敗的局部晚期或轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC）的二線治療。本研究觀察了厄洛替尼聯(lián)合survivin siRNA對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549的增殖抑制作用，探討二者聯(lián)合應(yīng)用是否具有協(xié)同效應(yīng)，以及survivin siRNA是否增強(qiáng)厄洛替尼的抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1.1 材料 p53野生型肺癌細(xì)胞株A549，河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院；靶向survivin的 siRNA、siRNA轉(zhuǎn)染試劑、siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、鼠抗人Survivin蛋白單克隆抗體、β-actin一抗及羊抗鼠二抗，Santa Cruz公司；MTT，上海華舜生物工程有限公司；二甲基亞砜(DMSO），成都天泰公司；二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；厄洛替尼，上海羅氏制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：A549細(xì)胞接種于50ml培養(yǎng)瓶，用含10%新生牛血清的RPMI l640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 survivin siRNA轉(zhuǎn)染(以6孔板為例）：轉(zhuǎn)染前1天用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，將A549細(xì)胞以2×105/孔接種于6孔板，至細(xì)胞融合約60%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別用survivin siRNA及陰性對(duì)照siRNA-A轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞(survivin siRNA與siRNA轉(zhuǎn)染試劑比例為1：1.2）。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為5組：空白對(duì)照組，siRNAA轉(zhuǎn)染對(duì)照組，survivin siRNA轉(zhuǎn)染組，厄洛替尼處理組，survivin siRNA轉(zhuǎn)染+厄洛替尼處理組?？瞻讓?duì)照組和厄洛替尼處理組細(xì)胞用含10%新生牛血清的RPMI l640培養(yǎng)液培養(yǎng)，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中厄洛替尼處理組細(xì)胞加入厄洛替尼，終濃度為12.5μmol/L。siRNA-A轉(zhuǎn)染對(duì)照組，survivin siRNA轉(zhuǎn)染組，survivin siRNA轉(zhuǎn)染+厄洛替尼處理組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6h后換為含l0%新生牛血清RPMI l640培養(yǎng)液，其中survivin siRNA轉(zhuǎn)染+厄洛替尼處理組加入厄洛替尼，終濃度為12.5μmol/ L。

1.2.4 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖：調(diào)整A549細(xì)胞濃度，以3×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染、加藥處理，48h后各組棄培養(yǎng)液，每孔加入MTT(5mg/ ml)20μl，37℃孵育4h，輕輕吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，振蕩10min。于490nm波長(zhǎng)處采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔光密度(OD)值，計(jì)算各組細(xì)胞抑制率。抑制率=[(空白對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白對(duì)照組OD值]×100%。

1.2.5 免疫組化染色觀察Survivin蛋白表達(dá)的變化：細(xì)胞爬片后經(jīng)轉(zhuǎn)染、加藥處理，培養(yǎng)48h后，采用二步法免疫組化染色方法觀察A549細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。以胞漿和(或）細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽(yáng)性。免疫組化染色結(jié)果根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比及著色強(qiáng)度進(jìn)行綜合分析：①陽(yáng)性細(xì)胞百分比：隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400），計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并計(jì)分，0分(＜5%）、l分(5%-25%）、2分（25%-50%）、3分(50%-75%）、4分(＞75%）。②著色程度：不著色為0分，淡黃色(弱陽(yáng)性）為1分，黃色或深黃色(中等陽(yáng)性）為2分，褐色或棕褐色(強(qiáng)陽(yáng)性）為3分。以陽(yáng)性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度分值的乘積作為每一例的積分，以積分作為Survivin蛋白的相對(duì)表達(dá)水平[1]。

2 結(jié)果

2.1 MTT法染色結(jié)果 siRNA-A轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞增殖未受到明顯抑制。與siRNA-A轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，survivin siRNA轉(zhuǎn)染組、厄洛替尼處理組及survivin siRNA+厄洛替尼處理組A549細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P＜0.01）；與survivin siRNA轉(zhuǎn)染組和厄洛替尼處理組比較，survivin siRNA轉(zhuǎn)染+厄洛替尼處理組細(xì)胞的抑制率明顯升高(P＜0.01）。2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示，survivin siRNA轉(zhuǎn)染和厄洛替尼處理兩種因素存在交互作用(F=44.105，P＜0.01），表現(xiàn)為協(xié)同作用。見附表。

附表 MTT法和免疫組化染色結(jié)果(±s）

附表 MTT法和免疫組化染色結(jié)果(±s）

與siRNA-A轉(zhuǎn)染對(duì)照組比較:*P＜0.01，與survivin siRNA轉(zhuǎn)染+厄洛替尼處理組比較:#P＜0.01

組別 抑制率(%) Survivin蛋白空白對(duì)照組 --- 8.85±0.67 siRNA-A轉(zhuǎn)染對(duì)照組 0.85±8.24 8.70±0.92厄洛替尼處理組 60.28±3.23*# 3.80±0.62*#survivin siRNA轉(zhuǎn)染組 47.68±4.09*# 3.40±0.94*#survivin siRNA轉(zhuǎn)染+厄洛替尼處理組 78.14±4.34* 1.15±0.37*

2.2 A549細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá) Surviving蛋白免疫陽(yáng)性產(chǎn)物位于A549細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，空白對(duì)照組及siRNA-A轉(zhuǎn)染對(duì)照組可見大量陽(yáng)性細(xì)胞，survivin siRNA轉(zhuǎn)染組、厄洛替尼處理組及survivin siRNA轉(zhuǎn)染+厄洛替尼處理組陽(yáng)性細(xì)胞較少(附圖）。Survivin蛋白定量分析結(jié)果見附表：survivin siRNA轉(zhuǎn)染組、厄洛替尼處理組及survivin siRNA轉(zhuǎn)染+厄洛替尼處理組Survivin蛋白的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組及siRNA-A轉(zhuǎn)染對(duì)照組(P＜0.01），且survivin siRNA轉(zhuǎn)染+厄洛替尼處理組明顯低于survivin siRNA轉(zhuǎn)染組和厄洛替尼處理組(P＜0.01）。

附圖 A549細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)(×400)

3 討論

厄洛替尼對(duì)肺癌患者相關(guān)癥狀具有良好的改善作用，咳嗽、呼吸困難與疼痛的改善率分別可達(dá)44%、34%和30%[2]。厄洛替尼不良反應(yīng)發(fā)生率較低，病人耐受性好，對(duì)于老年、一般情況較差的晚期NSCLC患者仍是安全有效的選擇。但由于幾乎所有的患者最后都會(huì)產(chǎn)生耐藥，限制了其長(zhǎng)期療效。厄洛替尼聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)含鉑一線化療方案不能額外改善生存率，因此迫切需要尋找能增強(qiáng)厄洛替尼抗腫瘤作用的方法[3]。逃避凋亡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和藥物抵抗的重要機(jī)制[4]。大量研究表明，survivin高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞可耐受化療、放療，下調(diào)survivin的表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞化療、放療時(shí)的凋亡[5]。Falleni等[6]的研究顯示了survivin基因在肺癌早期診斷中的價(jià)值，也是“基因沉默”治療比較理想的靶點(diǎn)[7]。有研究表明，在哺乳類、人類細(xì)胞中直接導(dǎo)入人工合成的siRNA，一方面可避免激活干擾素途徑，另一方面可使相應(yīng)序列的靶向基因mRNA產(chǎn)生明顯的特異性抑制效應(yīng)[8]。據(jù)此機(jī)制，依照靶基因mRNA設(shè)計(jì)序列特異性siRNA，可起到封閉特異性基因表達(dá)的作用。

本研究通過(guò)survivin siRNA沉默survivin的表達(dá)，并聯(lián)合應(yīng)用厄洛替尼，發(fā)現(xiàn)survivin siRNA轉(zhuǎn)染和厄洛替尼聯(lián)用對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，并能顯著降低A549細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)水平，明顯優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用厄洛替尼。因此表明，survivin siRNA轉(zhuǎn)染和厄洛替尼處理兩種因素具有協(xié)同作用，但作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本研究證明，轉(zhuǎn)染survivin siRNA沉默survivin的表達(dá)可增強(qiáng)厄洛替尼對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用，降低Survivin蛋白的表達(dá)水平，從而增強(qiáng)厄洛替尼的抗腫瘤作用。本研究為提高厄洛替尼對(duì)NSCLC的治療效果提供了新的治療思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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EFFECTS OF ERLOTINIB COMBINED SURVIVIN SIRNA ON PROLIFERATION OF HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A549

GU Lei, LV Xi-ying
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To investigate the effects of erlotinib combined survivin siRNA on proliferation of human lung adenocarcinoma cell line A549.Methods:The lung adenocarcinoma cell line A549 was treated with survivin siRNA transfection and erlotinib alone or in combination. MTT method was used to observe the inhibitory effects of proliferation on A549 cells, and immunohistochemical staining to observe expression of Survivin protein in A549 cells.Results:Erlotinib combined survivin siRNA had obvious inhibitory effects on A549 cells, and could obviously decreased expression of Survivin protein in A549 cells. There had obvious differences between erlotinib combined survivin siRNA and erlotinib or survivin siRNA alone (P＜0.01).Conclusions:Survivin siRNA silence the expression of survivin can enhance sensitivity of human lung adenocarcinoma cancer cell line A549 to erlotinib.

Erlotinib; Survivin siRNA; A549 cells

R734.2

A

1004-6879(2011）02-0122-03

2010-12-20）

△ 通訊作者