師豪 黃世龍 張孟柯 李潁 胡文玉 牛美蘭
(黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450000)
近年來(lái)以動(dòng)脈粥樣硬化(AS)為基礎(chǔ)的缺血性心腦血管病(包括冠心病和腦卒中)發(fā)病率逐年升高,心腦血管病已成為我國(guó)居民死亡的主要原因〔1〕。西藥在治療AS中機(jī)制明確,取得顯著作用,但往往效果單一,且副作用較大,不良反應(yīng)多。中藥以中醫(yī)理論為指導(dǎo),宏觀著手,整體施治,對(duì)AS這類復(fù)雜的疾病具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),且其有效成分不易散失,副作用小。葡萄籽原花青素(GSP)作為一種提取物,具有清除氧自由基、防止細(xì)胞老化和脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)細(xì)胞膜損傷、對(duì)抗血小板活化因子等多種藥理作用〔2〕,所以其防治AS的機(jī)制可能包括多個(gè)方面。維生素(V)E是主要的抗氧化劑之一,它本身的結(jié)構(gòu)可以清除氧自由基和過(guò)氧化物,可被VC或氧化還原系統(tǒng)復(fù)原,繼續(xù)發(fā)揮作用〔3〕。本研究分析GSP與VE的聯(lián)合抗氧化作用防治大鼠AS的機(jī)制。
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6~8周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,體重180~220 g,購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng),許可證編號(hào)(SCXK蘇2017-0001),存放在黃河科技學(xué)院動(dòng)物房,光照12 h/d,溫度20~23℃,相對(duì)濕度40%~60%,自由飲水和攝食。
1.2飼料 基礎(chǔ)飼料,高脂飼料配方(以下均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)):3%膽固醇、0.2%膽鹽、20%豬油、10%白糖及高蛋白基礎(chǔ)飼料(批號(hào):201733,南京盛民科研動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng))。
1.3實(shí)驗(yàn)試劑及藥品 血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)試劑盒(批號(hào):20171216)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(批號(hào):20171207)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(批號(hào):20171201)、一氧化氮(NO)試劑盒、血清超氧化物歧化酶(SOD)(批號(hào):20171218)、抗超氧陰離子(O2-)試劑盒(批號(hào):20171220)、抗羥自由基(-OH)試劑盒(批號(hào):20171219)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào):20171214),均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。免疫組化試劑盒(平頂山市慧眾源生物科技有限公司),GSP(批號(hào):20170704,河南明瑞食品添加劑有限公司),VE軟膠囊(批號(hào):170817Q,山東盛海保健品有限公司),VD3注射液(批號(hào):20170903,哈爾濱市宏達(dá)動(dòng)物藥品廠),氯化鈉注射液(批號(hào):1705020726,辰欣藥業(yè)股份有限公司),阿托伐他汀鈣片(批號(hào):171134,規(guī)格10 mg,北京嘉林藥業(yè)股份有限公司)。
1.4實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 電子天平(XJ320M,上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)、離心機(jī)(GT16-3A,北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)、分光光度計(jì)(UV-8000,上海元析儀器有限公司)、旋渦混勻器(DH300,杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司)、恒溫水浴槽(NKSY-15,常州諾基儀器有限公司)。
1.5造模方法 將實(shí)驗(yàn)大鼠用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)1 w,適應(yīng)環(huán)境后,將其分為空白組10只(喂基礎(chǔ)飼料)和造模組50只(喂高脂飼料),早晚各添加1次飼料,自由飲水,觀察記錄其基本狀況。造模期間,第1周內(nèi)腹腔注射VD 360萬(wàn)IU/kg后的第3、6、9周分別注射10萬(wàn)IU/kg〔4〕,每周測(cè)1次大鼠體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)9 w后,空白組和模型組各隨機(jī)抽出2只,腹腔靜脈采血測(cè)血脂水平及抗氧化指標(biāo),截取胸主動(dòng)脈用免疫組化法做病理切片確認(rèn)造模成功。
1.6分組給藥方法 在建立高血脂模型基礎(chǔ)4 w后,將造模組分為5組:模型組;GSP+VE低、中、高劑量組;阿托伐他汀組,每組10只,繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)。GSP+VE低、中、高劑量組分別給予GSP〔45 mg/(kg·d)〕和VE〔15 mg/(kg·d)〕、GSP〔90 mg/(kg·d)〕和VE〔5,6〕〔30 mg/(kg·d)〕、GSP〔180 mg/(kg·d)〕和VE〔60 mg/(kg·d)〕灌胃;陽(yáng)性對(duì)照給予研磨碎的阿托伐他汀鈣片〔7,8〕〔1.05 mg/(kg·d)〕灌胃,以上藥物均加用生理鹽水〔1.33 ml/(kg·d)〕;模型組灌胃同劑量的生理鹽水,連續(xù)干預(yù)4 w。
1.7樣品采集與指標(biāo)測(cè)定 其他條件不變,各組于第10周稱重,腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉,固定四肢,打開(kāi)腹腔,促凝真空管腹腔靜脈取血,3 500 r/min離心10 min,分離血清于-4℃冰箱保存;根據(jù)試劑盒說(shuō)明測(cè)其血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量〔9〕及SOD、MDA、NO的含量和抗O2-、抗-OH的能力并對(duì)比分析。
1.8組織學(xué)染色 分離1 cm長(zhǎng)的胸主動(dòng)脈,10%中性甲醛固定,經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋并制成4 μm石蠟切片,常規(guī)HE染色,400倍光鏡下觀察。
1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和組間SNK-q檢驗(yàn)。
2.1大鼠的一般狀況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,模型組3只,逐漸厭食、消瘦,還有突發(fā)的急性死亡,考慮與高脂飼料和注射大劑量VD3有關(guān);GSP+VE低劑量組3只,大鼠狀況、死亡原因與模型組相似;GSP+VE中劑量組1只,狀況同模型組,因疑似肺炎,直接處死;阿托伐他汀組4只,考慮到個(gè)體差異,不能耐受藥物副作用,死亡4只。
2.2各組血脂水平 與空白組相比,模型組血清的TC、TG、LDL-C的含量均顯著增加(P<0.05),且TC增加更顯著(P<0.01),HDL-C的含量顯著減少(P<0.05),各給藥組(除阿托伐他汀組HDL-C水平外)血清TC、TG含量顯著高于空白組,(除阿托伐他汀組HDL-C水平外)HDL-C、LDL-C含量無(wú)顯著差異;與模型組相比,GSP+VE中、高劑量組和阿托伐他汀組血清TC、TG、LDL-C的含量均顯著減少,HDL-C含量顯著增加(P<0.05),GSP+VE低劑量組LDL-C水平顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表1。
表1 各組血脂水平
與空白組比較:1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較:3)P<0.05,4)P<0.01;表2同
2.3各組抗氧化水平 與空白組相比,模型組血清中T-SOD活力、抑制O2-、-OH的能力、NO含量降低,MDA含量升高,差異均顯著(P<0.05或P<0.01),各給藥組抗氧化水平趨于空白組;與模型組相比,GSP+VE各劑量組血清T-SOD活力、抑制O2-的能力、NO含量依次升高(P<0.05或P<0.01),低劑量組MDA含量及抑制-OH能力無(wú)顯著變化(P>0.05),高劑量組MDA含量降低,抑制-OH能力增強(qiáng)(P<0.05),阿托伐他汀組NO含量、T-SOD活力升高,MDA含量降低,差異顯著(P<0.05),抑制O2-、-OH能力無(wú)顯著差異(P>0.05),見(jiàn)表2。
表2 各組抗氧化水平
2.4胸主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)觀察 藥物干預(yù)4 w后,光鏡下空白組主動(dòng)脈壁內(nèi)皮完整,分界較清晰,內(nèi)膜光滑,平滑肌細(xì)胞均勻排列。GSP+VE高劑量組內(nèi)皮細(xì)胞下有脂質(zhì)沉積,其形態(tài)學(xué)變化接近于空白組;模型組主動(dòng)脈內(nèi)大量鈣鹽沉積并有向管腔內(nèi)凸起的斑塊,中膜內(nèi)層出現(xiàn)斷裂,平滑肌細(xì)胞發(fā)生變性壞死,GSP+VE低劑量組動(dòng)脈內(nèi)膜有粥樣斑塊沉積。阿托伐他汀組動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增生腫脹并有脂肪細(xì)胞浸潤(rùn),中膜平滑肌細(xì)胞腫大增生、排列紊亂,GSP+VE中劑量組動(dòng)脈內(nèi)泡沫樣脂肪沉積,內(nèi)膜增厚,細(xì)胞增生腫大明顯,排列明顯紊亂。見(jiàn)圖1。
圖1 各組胸主動(dòng)脈病理變化(HE,×400)
楊小蓉等〔10〕報(bào)道,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始分4 次腹腔注射VD3共70萬(wàn)IU/kg,用不同TC含量的高脂飼料探討對(duì)造模的影響,本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上用3% TC聯(lián)合腹腔注射大劑量VD3,9 w后胸主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)顯示復(fù)制模型成功,與文獻(xiàn)相符。理論上血液TC增加,由此產(chǎn)生過(guò)多的LDL積聚在血管壁內(nèi)并被游離氧氧化成氧化型LDL,進(jìn)而被巨噬細(xì)胞吞噬,形成泡沫細(xì)胞吸附于血管壁,為AS形成創(chuàng)造條件。
本實(shí)驗(yàn)中,造模大鼠死亡率高的原因可能是:高脂飼料中TC含量過(guò)高影響口感、食欲;灌藥干預(yù)第1周,GSP使用劑量過(guò)大,加之味苦,導(dǎo)致其厭食、體質(zhì)量下降,調(diào)整給藥劑量停藥1 w后再次灌藥干預(yù),體質(zhì)量增加狀況良好;大劑量VD3導(dǎo)致高鈣血癥誘發(fā)消化、泌尿系統(tǒng)功能障礙和心律失常,解剖急性死亡的大鼠,發(fā)現(xiàn)肝臟、腎臟表面均有白色密集的鈣化斑,甚至出現(xiàn)尿潴留。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:GSP聯(lián)合VE能提高大鼠的免疫力,延長(zhǎng)其存活時(shí)間,阿托伐他汀雖有降血脂效果,卻對(duì)機(jī)體造成的毒副反應(yīng)極大,不能耐受的機(jī)體死亡率增高。與模型組相比,GSP+VE各劑量組血脂水平依次改善,另外中、高劑量組能明顯改善血清抗氧化指標(biāo)(P<0.05或P<0.01),阿托伐他汀組光鏡下的動(dòng)脈管壁仍有脂肪細(xì)胞浸潤(rùn),考慮與持續(xù)食用高脂飼料和藥物治療時(shí)間短有關(guān),建議后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中延長(zhǎng)給藥時(shí)間,以便提供更為準(zhǔn)確的陽(yáng)性對(duì)照。
大劑量VD3引發(fā)的高鈣血癥會(huì)導(dǎo)致Ca的異位沉積,機(jī)體細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,活性氧(ROS)產(chǎn)生過(guò)多,細(xì)胞內(nèi)鈣超載,Ca沉積線粒體使細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào),氧自由基增多并作用于脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng),氧化終產(chǎn)物為MDA,其含量可間接反映細(xì)胞損傷的程度。鈣超載時(shí),鈣依賴性磷脂酶A2激活,使花生四烯酸(AA)生成增加,通過(guò)環(huán)加氧酶和脂加氧酶作用產(chǎn)生大量H2O2和-OH〔11〕。機(jī)體發(fā)生高脂血癥時(shí),內(nèi)皮細(xì)胞損傷,NO合酶(NOS)基因表達(dá)減少,導(dǎo)致NO產(chǎn)生不足〔12〕,抑制LDL被氧化的能力下降,從而產(chǎn)生泡沫細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)展為AS。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后,暴露出內(nèi)皮下膠原,此時(shí)在Ca2+和NO減少的作用下,血流中血小板不斷黏附聚集,血栓素A2和生長(zhǎng)因子釋放增多,一方面促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖和動(dòng)脈基質(zhì)層蛋白質(zhì)合成,降低血管壁的順應(yīng)性;另一方面激活凝血因子,啟動(dòng)了內(nèi)源性凝血過(guò)程,因此嚴(yán)重的AS潰瘍是導(dǎo)致血栓形成的常見(jiàn)原因。GSP聯(lián)合VE的抗氧化機(jī)制是GSP通過(guò)回收脂溶性VE和減少DNA氧化損傷來(lái)發(fā)揮作用〔13〕。綜上,GSP聯(lián)合VE具有改善血脂水平和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用,從而降低AS過(guò)程中活性自由基對(duì)血管的損害。