宋月

摘 要：本次試驗所使用的圖樣主要由雞場周圍環(huán)境中采集，利用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基平板實現(xiàn)對大腸桿菌的分離純化。然后將其作為宿主針對相應(yīng)的噬菌體進(jìn)行研究。通過結(jié)果發(fā)現(xiàn)我們共分離到4株大腸桿菌，經(jīng)過鑒定后其在埃希氏大腸桿菌涵蓋范圍之內(nèi)。主要有多面體頭部以及尾部共同組成，這是利用負(fù)染經(jīng)電鏡觀察所取得的結(jié)果。在人工胃液條件的影響下即會死亡，通過對其生長曲線進(jìn)行測定后發(fā)現(xiàn)裂解能力相當(dāng)強。因此，在雞舍環(huán)境治理中該噬菌體所起到的應(yīng)用價值就高。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；噬菌體；生物學(xué)特性

畜禽機體以及養(yǎng)殖環(huán)境事大腸桿菌分布的主要位置。致病性以及非致病性是大腸桿菌的兩種主要形式。幼雛畜禽腹瀉以及土壤與水體污染等都會在一定程度上受到大腸桿菌的影響。在預(yù)防大腸桿菌過程當(dāng)中我們可通過對幼雛動物進(jìn)行疫苗接種的方式進(jìn)行。物理法與化學(xué)法是傳統(tǒng)環(huán)境消毒所使用的方法，但是這種方法存在一定的缺陷，還會造成二次污染環(huán)境的問題出現(xiàn)。因此，現(xiàn)階段我們面對的主要問題就是實現(xiàn)對靶向特異殺菌以及長期持續(xù)作用生物消毒劑的尋找。

一、材料與方法

1.材料

（1）菌種與樣品

E.coli078、E.coli2116、E.coli25922均由山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室提供。污水及糞便樣品來源于泰安市郊區(qū)養(yǎng)雞基地。

（2）培養(yǎng)基及試劑LB培養(yǎng)基

蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，去離子水1000ml，pH7.0，121℃20min高壓滅菌；人工胃液（pH1.2）：NaCl2g，HCI（12mol/L）7mL，超凈水1000mL，胃蛋白酶3.2g，0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

2.方法

（1）大腸桿菌的分離純化及鑒定

將雞場采集的樣品于EMB平板上反復(fù)劃線，直至得到大小、形態(tài)均一的具金屬光澤的單菌落，進(jìn)行鏡檢。進(jìn)一步采用DNA試劑盒提取菌體DNA，并對其進(jìn)行16SrDNA序列擴增，所用引物為通用引物。

（2）大腸桿茵噬菌體的分離純化

取樣品1g加到5mLLB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)1h，釋放噬菌體；取500μL，對數(shù)期宿主菌液加入到上述溶液中，振蕩培養(yǎng)過夜，6000r/min離心5min，上清液為噬菌體裂解液。采用Adams雙層平板法，取200μL對數(shù)期的宿主菌液與適當(dāng)稀釋的100μL噬菌體液混合于4.5mL上層半固培養(yǎng)基中，倒入已鋪好的水瓊脂平板上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，根據(jù)所形成的噬菌斑的形態(tài)，依據(jù)上述方法反復(fù)純化，直至得到形態(tài)大小均一的噬菌斑。

二、結(jié)果與分析

1.噬茵體的分離純化及形態(tài)觀察結(jié)果

將分離出的4株大腸桿菌作為宿主菌實現(xiàn)對噬菌體的相應(yīng)分離，分離范圍為雞場樣品。當(dāng)E.coliLY4作為宿主存在使我們可實現(xiàn)對一株烈性噬菌體的獲取。對其進(jìn)行純化后直徑可達(dá)到2.5-3.8mm，裂解性相當(dāng)清晰。通過電鏡對噬菌體進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)具備頭部多面體，直徑大概維持在70-90mm之間，尾部長度最高可達(dá)到200mm，有較為清晰的頸部存在于頭部與尾部之間，可以說在蝌蚪狀的可收縮尾的噬菌體涵蓋范圍之內(nèi)，我們將其命名為φLY4。在測定噬菌體效價過程當(dāng)中需要使用Adams雙層平板法。

2.噬菌體pH、熱穩(wěn)定性分析

噬菌體垂LY4對pH的適應(yīng)范圍較廣，在pH5.0～10.0仍能保持較高活性，效價在109左右；pH4.0時，活性開始下降，對pH4.0以下的酸性環(huán)境耐受性低于對堿性環(huán)境的耐受性；噬菌體φLY4在-20、4、18和37℃保溫100min后，效價變化均在一個數(shù)量級范圍內(nèi)，且能保持較高的活性，效價在109左右；在60℃作用下，活性喪失較明顯，效價下降到107左右；因此，該噬菌體在-20～37℃之間能保持較好的穩(wěn)定性。

三、討論

通過上述分析可以發(fā)現(xiàn)，機場周圍的土壤與環(huán)境有大量大腸桿菌噬菌體分布。這不僅可實現(xiàn)對病原菌的有效清除，同時對環(huán)境惡臭的改善也有較為積極的作用。在分析雞場土樣過程當(dāng)中可實現(xiàn)對噬菌體φLY4的獲取，其主要組成部分為多面體頭部以及尾部，在裂解活性方面占據(jù)相當(dāng)強的優(yōu)勢。2.5-3.8mm是噬菌斑直徑大概范圍，潛伏期以及裂解期較短是其明顯特征。在較短的時間內(nèi)即可實現(xiàn)對宿主細(xì)胞的有效殺死，該種特性的應(yīng)用價值相當(dāng)高。本次研究速度是來源不同的大腸桿菌。在此基礎(chǔ)上針對宿主范圍進(jìn)行測定，證實其專一性較為嚴(yán)格，所以在使用過程當(dāng)中會受到一定程度的限制。通過研究可以發(fā)泄。廣譜噬菌體可通過人工改造技術(shù)實現(xiàn)對噬菌體宿主譜的逐步發(fā)展，或者將其改造為定向宿主。這不僅可促使其應(yīng)用潛力得到改善，同時對環(huán)境的進(jìn)一步發(fā)展有重要作用。

在對噬菌體對溫度及PH進(jìn)行確定時我們需要借助生物活性對其進(jìn)行測定，取得結(jié)果證明其范圍較寬。在溫度維持在-20-37℃時，宿主菌的感染性相當(dāng)強，溫度逐步升高其活性會逐步減弱，直至60°C完全消失，這為噬菌體制劑研制以及加工工作的順利開展打下堅實基礎(chǔ)。注意在針對田間環(huán)境進(jìn)行推測時，我們可利用排除溫度的方法對其影響進(jìn)行進(jìn)一步分析。其較高的活性需要將PH值維持在5.0-10.0之間，相對于酸的耐受性來說，該種噬菌體對堿的耐受性明顯較高。導(dǎo)致上述現(xiàn)象出現(xiàn)的原因有很多種，大腸桿菌幾乎在中性或者偏堿性環(huán)境中進(jìn)行生存就是其中之一。宿主菌在酸性條件下生長會受到一定的抑制，因此破壞到噬菌體的一系列生長與繁殖，所以噬菌體效價長期得不到有效提升，嚴(yán)重時會出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。在處理事君體的過程當(dāng)中，如果使用人工胃液會直接導(dǎo)致其死亡，這與不耐酸結(jié)果之間呈現(xiàn)出一種相契合的狀態(tài)。在此基礎(chǔ)上可以推測出該種噬菌體不適合口服。尤其是畜禽不會因為誤食該種是菌體而導(dǎo)致體內(nèi)的微生態(tài)平衡被破壞。

結(jié)語：噬菌體在生存過程當(dāng)中主要是依附細(xì)菌，其繁殖與裂解也需要借助細(xì)菌宿主來完成，現(xiàn)階段作為一種傳統(tǒng)的化學(xué)治療逐步引起社會各界的廣泛關(guān)注。大腸桿菌對畜牧養(yǎng)殖有相當(dāng)大的危害，土壤以及水體是大腸桿菌分布的主要范圍，如果能利用噬菌體實現(xiàn)對生物消毒劑的制作，即可在處禽養(yǎng)殖環(huán)境污染方面起到不可替代的重要作用。但是我們需要借助必要的措施與手段實現(xiàn)對殺菌范圍的不斷提高，尤其是要在合理應(yīng)用試菌體變異等問題的基礎(chǔ)上，改善養(yǎng)殖環(huán)境。

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