楊三維，李劉軍，喬 玲，趙佳佳，鄭興衛(wèi)，葛 川，蘆艷珍，田 鵬

（1山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西臨汾041000；2山西大學(xué)商務(wù)學(xué)院體育系，太原030006）

0 引言

當(dāng)前食品和飲料等行業(yè)多使用合成色素作為著色劑，合成色素往往具有致癌、致突變等副作用，易對(duì)人體健康產(chǎn)生不良影響[1]。天然色素除可作為著色劑使用外，還具有營養(yǎng)價(jià)值和藥理作用。隨著人們不斷追求健康、天然和高品質(zhì)的生活質(zhì)量，天然色素必將取代化學(xué)合成色素?；ㄉ兆鳛橐环N安全、無毒的天然色素，對(duì)人體具有多種保健功能，常用于清除體內(nèi)自由基、增殖葉黃素，具有抗腫瘤、抗癌、抗炎、抑制脂質(zhì)過氧化和血小板凝集等作用[2-3]。目前植物花色苷的提取多以新鮮植物為原料，受季節(jié)影響很大，已有從藍(lán)莓、桑葚、葡萄皮、黑加侖和紫薯等植物中提取花色苷方法的報(bào)道，提取出的花色苷應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、工業(yè)等領(lǐng)域，體現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛力[5-7]。植物花色苷的提取方法多采用酸堿溶液分步提取法，存在提取率低、活性差的缺點(diǎn)，酸堿液對(duì)后續(xù)的純化設(shè)備損害也比較大。此外，這些方法提取出的花色苷雜質(zhì)較多，其中的多糖、蛋白和淀粉容易對(duì)人產(chǎn)生過敏等影響。也有利用超聲波和復(fù)合酶等方法提取花色苷的報(bào)道[8-9]，具有周期短、得率高的特點(diǎn)，但尚未應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。因此，尋找、開發(fā)新的植物花色苷來源以及高純度的提取方法具有重要意義。

紫小麥?zhǔn)且环N理想的天然食品資源，紫小麥種皮富含天然花色苷類化合物而呈現(xiàn)紫色，其紫粒特性是由長穗偃麥草和四倍體與小麥的遠(yuǎn)緣雜交而來，不同來源紫小麥所含有的紫色素成分不同[10]。關(guān)于紫小麥花色苷的提取已有報(bào)道，傅虹飛等[11]和蔣彥婕等[8]研究了紫小麥花色苷超聲波輔助提取工藝，李偉等[12]利用酸化乙醇法提取麩皮中花色苷的工藝。與紫薯和藍(lán)莓等其他植物相比，小麥花色苷的提取率偏低，所用紫麥品種不明確也導(dǎo)致其花色苷種類未知，這些因素限制了小麥花色苷的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用。因此，尋找、挖掘穩(wěn)定的紫麥花色苷來源以及高純度的提取方法一直倍受重視。為提升紫小麥綜合利用價(jià)值，本文提供了一種高純度、低成本的花色苷提取工藝，研究了小麥花色苷的抗氧化和染毛特性，以期為紫小麥花色苷的進(jìn)一步應(yīng)用開發(fā)提供新方法和新材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

當(dāng)前推廣面積較大的紫小麥品種‘農(nóng)大3753’，由山西省農(nóng)科院小麥研究所保存。

1.2 原料預(yù)處理

收集出粉率為75%左右的紫小麥麩皮，麩皮主要成分為種皮、胚和少量胚乳，將麩皮用麥麩粉碎機(jī)（WFJ-15，佳科機(jī)械制造有限公司）粉碎至200目后貯藏備用。

1.3 花色苷提取工藝

CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）浸提液配方為：十六烷基三甲基溴化銨23 g，乙二胺四乙酸二鈉3 g，蔗糖5 g，檸檬酸6 g，定容至1 L；所用試劑均為國產(chǎn)分析純（北京化工廠），試驗(yàn)過程參考文獻(xiàn)[13]進(jìn)行，增加脫蛋白和去多糖等步驟。

1.4 小麥花色苷的提取工藝優(yōu)化

以料液比、提取次數(shù)和提取時(shí)間為自變量，單因素試驗(yàn)優(yōu)化紫小麥花色苷提取的最優(yōu)工藝參數(shù)。

1.5 花色苷的含量和色價(jià)測定

參考文獻(xiàn)[14]，采用pH值示差法測定花色苷含量，具體步驟為：取pH 1.0氯化鉀-鹽酸緩沖液和pH 4.5醋酸鈉緩沖液各9 mL，加入待測樣品1 mL混勻后，利用紫外-可見分光光度計(jì)（日立U-2010型）檢測。根據(jù)式(1)計(jì)算花色苷含量。式(2)用于起始標(biāo)量的計(jì)算。

式中，V為提取總體積，n為稀釋倍數(shù)，449為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量(g/mol)，26900為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)(L·mol/cm)，m為樣品質(zhì)量(g)。

通過520 nm的吸光值測定花色苷色價(jià)值，具體方法為：稱取1 g花色苷粉末，用pH 3.0的檸檬酸緩沖液溶解并定容至100 mL，再進(jìn)行適當(dāng)稀釋使吸光值在0.2～0.8，緩沖液作對(duì)照，計(jì)算如式(3)，式中，%表示試樣濃度為1%的色價(jià)。

1.6 花色苷成品標(biāo)準(zhǔn)檢測

采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（法國JY138）和原子吸收光譜儀（日立-Z5000）檢測提取物金屬含量。元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL)由國家標(biāo)準(zhǔn)溶液(NCS)稀釋而成，試驗(yàn)用水為去離子水。ICP分析條件：譜線波長As為193.7 nm，工作功率1250 W，入射狹縫18 nm，出射狹縫79 nm，進(jìn)樣速率1.5 mL/min，載氣壓力0.25 MPa，護(hù)套氣量0.18 L/min，冷卻氣流量18 L/min。原子吸收分析條件：燈電流7.5 mA，狹縫1.3 nm，燃燒器高度7.5 mm，火焰類型為貧燃。提取物中金屬總含量通過比色法測定，按照國家標(biāo)準(zhǔn)《有機(jī)化工產(chǎn)品中重金屬的測定》編號(hào)GB/T 7532—2008進(jìn)行。

1.7 花色苷抗氧化活性檢測

在含有H2O2魯米諾發(fā)光體系中檢測不同濃度小麥花色苷的清除活性氧的IC50，在測定瓶中依次加入100 μL濃度為5 mol/L的H2O2和0.2 mol/L pH 9.7的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液500 μL，再加入不同濃度的供試樣品，蒸餾水作為空白對(duì)照；混合均勻后加入5 mol/L的魯米諾和10 mol/L的CTMAB（十六烷基三甲基溴化銨）等量混合液500 μL啟動(dòng)反應(yīng)，將樣品置于液閃測定儀中，延時(shí)10 s，測定12 s內(nèi)的發(fā)光強(qiáng)度。

1.8 紫小麥花色苷羊毛染色

將羊毛放入Na2CO3溶液中浸泡，可以促使染料分子與毛發(fā)蛋白結(jié)合；再用金屬鹽作為媒染劑與花色苷分子顯色，并固定染料分子；最后將花色苷與金屬離子作用顯色并固定，從而使羊毛著色。具體方法為：先將洗凈的白色羊毛放入Na2CO3預(yù)處理液中10 min，在金屬離子媒染劑中處理10 min后洗凈，最后放入3%花色苷溶液中染色10 min，觀察其顏色的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷提取工藝

在對(duì)紫小麥麥麩進(jìn)行充分粉碎的條件下，采用改良CTAB法在室溫下提取花色苷，同時(shí)使用pH值沉淀和有機(jī)溶劑沉淀去除蛋白和多糖等雜質(zhì)。具體工藝為：（1）取粉碎后的麥麩0.5 kg，按照一定(m/v)比例使用CTAB液浸提，12000 g離心10 min，取上清。（2）使用HCl將離心后上清液調(diào)至pH 4.2，10000 g離心15 min，棄沉淀。（3）用NaOH將上清液調(diào)節(jié)至pH 8.0，10000 g離心15 min。（4）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將以上提取液濃縮至0.25 L后，再加入2倍體積99%的乙醇去除多糖，12000 g離心10 min棄沉淀。（5）大孔吸附樹脂(AB-8)吸附色素后，20%～30%的乙醇洗脫雜質(zhì)，再用60%的乙醇解吸樹脂中吸附的色素。（6）使用耐乙醇的有機(jī)鈉濾膜對(duì)解吸液進(jìn)行濃縮，得到濃度10%左右的濃縮液。（7）采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)一步濃縮樣品至100 mL左右，12000 g離心10 min，去除雜質(zhì)和不溶絡(luò)合物。（8）設(shè)定干燥器進(jìn)風(fēng)溫度為160℃，出風(fēng)溫度為75℃，噴霧干燥得到花色苷成品。

2.2 小麥花色苷的提取方法優(yōu)化

已有文獻(xiàn)研究表明，提取次數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間和料液比是影響小麥花色苷提率的主要因素[9,11-12]。為了保持花色苷穩(wěn)定性，在室溫條件下優(yōu)化小麥花色苷的提取方法，以提取次數(shù)、提取時(shí)間和料液比為自變量，提取量為響應(yīng)值進(jìn)行單因素試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著提取時(shí)間的增加，花色苷的提取率提高，當(dāng)提取時(shí)間超過60 min后花色苷提取率則出現(xiàn)下降趨勢（圖1A）。原因可能是提取時(shí)間過長，使得組織中大量的細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)大量不溶物及黏性物質(zhì)等混入到提取液中，導(dǎo)致溶液中雜質(zhì)增多，黏度增大，影響了花色苷的溶出；另一方面隨著提取時(shí)間的延長，花色苷的多糖分子鏈斷裂，在醇沉處理過程中損失增大，從而降低了花色苷的提取率，由此，確定花色苷的最佳提取時(shí)間為60 min（圖1B）。將麥麩粉以不同比例加提取液進(jìn)行提取，隨著提取液用量的不斷增大，花色苷提取率明顯提高，原因可能是溶劑比例的增加可有效降低溶液的黏度，提高了濃度差，有利于花色苷分子擴(kuò)散（圖1C），確定花色苷提取的料液比為1:3為宜。以料液比為1:3，提取時(shí)間60 min條件下，研究了提取次數(shù)對(duì)花色苷提取率的影響，從圖1A中可以看出，隨著提取次數(shù)增多，花色苷的得率增加，但超過3次以后，提取率降低。因此，根據(jù)單因素確定的最佳提取參數(shù)，采用提取次數(shù)為3次、提取時(shí)間為60 min和料液比為1:3.2在室溫下進(jìn)行小麥花色苷提取，花色苷的得率為3.20 g/kg。

2.3 紫小麥花色苷紫外光譜分析

從圖2中可以看出，提取出的花色苷樣品只在520～540 nm處有較強(qiáng)的花色苷吸收峰出現(xiàn)，310～355 nm處花青素?；Y(jié)構(gòu)的特征峰峰位沒有出現(xiàn)，表明花色苷純度較高；280 nm處蛋白質(zhì)吸收峰較低，說明采用pH值沉淀法有效脫除了蛋白?；ㄉ諡樘桥潴w，分子量較大，導(dǎo)致提取物中含有大量的多糖、蛋白和淀粉，極大地限制了花色苷的應(yīng)用，而用本工藝提取的花色苷雜質(zhì)少、純度較高。

2.4 花色苷成品標(biāo)準(zhǔn)檢測

為進(jìn)一步明確提取出的花色苷中金屬含量等相關(guān)指標(biāo)，采用比色法測定總金屬含量，原子吸收光譜儀和離子體原子發(fā)射光譜儀測定鉛和砷等物質(zhì)的含量。從表1可以看出，提取的花色苷其色價(jià)為170，其中，重金屬總含量小于29 μg/g，遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)；鉛和砷等毒性較大的金屬離子均未檢出；干燥失重后僅為4.6%，灰分成分為2.4%，2項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到了商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)[20]。

圖1 不同條件對(duì)花色苷提取率的影響

圖2 花色苷提取的紫外-可見光譜

表1 紫小麥種皮花色苷性質(zhì)檢測

2.5 花色苷抗氧化性評(píng)價(jià)

傅虹飛等[11]研究證明小麥花色苷具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力，但未與相關(guān)抗氧化劑進(jìn)行對(duì)比。為明確‘農(nóng)大3753’紫小麥花色苷的抗氧化特性，在含有H2O2魯米諾發(fā)光體系中進(jìn)行檢測，試驗(yàn)結(jié)果表明，加入的抗氧化劑濃度越高，對(duì)活性氧的清除率越高。IC50為抑制氧化發(fā)光50%時(shí)所需清除劑濃度，以清除百分率對(duì)清除劑濃度比較可計(jì)算出IC50為1.52。張立偉等[14]發(fā)現(xiàn)連翹活性物對(duì)活性氧具有較強(qiáng)的清除能力，對(duì)H2O2清除能力IC50為1.618，相同濃度的條件下，小麥花色苷具有較強(qiáng)的清除H2O2的能力。

2.6 小麥花色苷羊毛染色

小麥花色苷應(yīng)用研究開展較少，未見用于毛發(fā)染色的有關(guān)報(bào)道。本工藝提取的紫小麥花色苷具有較高的純度和色價(jià)，因此，進(jìn)行了羊毛染色的相關(guān)試驗(yàn)。從圖3看出，花色苷與不同金屬元素作用可將羊毛染成不同顏色，MgSO4-花色苷顯紫紅色，F(xiàn)eSO4-花色苷顯土黃色，AlCl3-花色苷顯棕色，F(xiàn)eCl3-花色苷顯藍(lán)紫色。

3 討論

近年來，國內(nèi)紫小麥的種植面積不斷增加，‘農(nóng)大3753’、‘寧春46’和‘河?xùn)|烏麥’已有穩(wěn)定種植面積[15]。紫小麥的開發(fā)大多以面粉為主，富含花色苷的麥麩產(chǎn)量大，但利用率卻很低，大部分用作動(dòng)物飼料，造成了原料的廉價(jià)消耗。當(dāng)前，小麥花色苷的提取多采用酸堿抽提，劉慧芳等[15]采用酸化乙醇浸提法提取的紫小麥花色苷得率為(0.87±0.21)g/kg；也有利用超聲波和高溫提取的報(bào)道[16-17]，如傅虹飛等[11]采用超聲波輔助提取得到小麥花色苷得率為(1.82±0.23)g/kg，是普通浸提法的2倍。由于麥麩中含有較多的淀粉和蛋白，加之酸堿裂解，導(dǎo)致提取出的花色苷活性較低，極大地限制了小麥花色苷的開發(fā)和利用。CTAB法目前主要用于植物DNA的提取，是一種較為溫和高效的植物破除細(xì)胞壁的方法，目前尚未見利用CTAB法提取植物色素的研究報(bào)道。筆者改良CTAB法后用于提取小麥麩皮中的花色苷，紫小麥花色苷得率為3.20 g/kg，高于前2種方法。此外，在提取過程中添加了去多糖和淀粉的步驟大大提高花色苷的純度，為小麥花色苷的進(jìn)一步利用奠定了基礎(chǔ)。

圖3 花色苷羊毛染色樣品.

在抗氧化方面，張立偉等[14]發(fā)現(xiàn)連翹活性物對(duì)活性氧具有較強(qiáng)的清除能力，筆者提取的花色苷對(duì)H2O2清除能力高于連翹皂甙。此外，金屬元素分析研究表明，CTAB法提取出的花色苷重金屬含量很低，達(dá)到了國家食品藥品的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)?？梢娮闲←滬熎せㄉ盏捏w外抗氧化活性高，在抗氧化功能性食品或功能因子添加劑方面具有較大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。毛發(fā)染色已成為美妝領(lǐng)域最流行的產(chǎn)品，目前全球染發(fā)需求市場年平均增長約5%，在未來仍將不斷增長[18-19]。目前永久型染發(fā)劑的染料中間體一般采用具有毒性的苯二胺及其衍生物[20-22]，因此，隨著人類健康意識(shí)的增強(qiáng)和科技的進(jìn)步，有毒染料會(huì)逐漸退出市場。法國、英國等歐洲國家已研制出蘇木精為原料的植物染發(fā)劑，日本也有市售的辣椒素、單寧酸、胭脂紅酸等植物天然毛發(fā)染色劑[19,23-24]。在中國歷來就有利用何首烏、蘇木精和胡桃醌等天然色素進(jìn)行染發(fā)的傳統(tǒng)[25]，均是基于花色苷可與多種金屬元素結(jié)合顯色的原理。因此，筆者采用與人類頭發(fā)組織結(jié)構(gòu)相似的羊毛為原料，通過不同金屬元素與花色苷結(jié)合進(jìn)行羊毛染色，初步結(jié)果表明小麥花色苷作為染發(fā)劑的可行性和著色穩(wěn)定性，這些結(jié)果進(jìn)一步拓寬了小麥花色苷的應(yīng)用和研究范圍。