曹小漢 任莉萍 舒 玉 張金波

（阜陽師范學院生物與食品工程學院 安徽阜陽 236037）

細胞骨架的制備及觀察是細胞生物學實驗教學中的重要實驗項目。 細胞骨架是真核細胞胞質(zhì)中存在的蛋白纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)， 包括微絲（microfilament，MF）、微管（microtubule，MT）和中間絲（intermediate filament，IF）3 種結(jié)構(gòu)組分［1］。 研究表明，細胞骨架除了保持細胞形狀、分隔固定細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)和參與構(gòu)成某些細胞器外，還具有物質(zhì)運輸、信號傳遞、參與細胞運動、分化、增殖，以及調(diào)節(jié)基因表達等作用［2-3］。由于細胞骨架在細胞生命周期中的重要作用及其與生命活動的密切聯(lián)系，細胞骨架的研究已成為細胞生物學乃至生命科學、醫(yī)學等諸多領(lǐng)域的研究熱點［4］。在本科生的細胞生物學實驗教學中，細胞骨架的制備及顯微觀察通常是必開實驗。 以動物離體的成纖維或上皮細胞作為細胞骨架制備的常用材料，不僅對細胞培養(yǎng)、保存設(shè)備及試劑要求較高，且實驗周期較長［5］。而植物細胞骨架制備取材方便，對實驗儀器設(shè)備要求不高， 操作簡單且周期短，是細胞骨架制備及觀察的實用材料。 以新鮮的洋蔥鱗莖為實驗材料， 用適當濃度的去垢劑TritonX-100處理細胞，可溶解膜脂，并與大部分非骨架蛋白疏水區(qū)結(jié)合而將其溶解，剩下的纖維狀細胞骨架蛋白比較穩(wěn)定而不被溶解，經(jīng)戊二醛固定和蛋白質(zhì)染料考馬斯亮藍R250 染色后， 可在光學顯微鏡下觀察到網(wǎng)狀的細胞骨架結(jié)構(gòu)。

由于實驗過程中的相關(guān)步驟對于實驗結(jié)果都非常重要， 例如實驗材料洋蔥的新鮮程度、TritonX-100 的處理時間、 戊二醛固定時間、 考馬斯亮藍R250 的染色時間等，所以學生在實驗過程中很難全面掌握每個環(huán)節(jié)的要領(lǐng)，因此，不易獲得質(zhì)量較高的細胞骨架裝片， 從而影響觀察效果。 筆者經(jīng)長期摸索，總結(jié)了完整且成熟的洋蔥細胞骨架的制備技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料 新鮮的洋蔥鱗莖。

1.2 方法

1）采樣。 用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)側(cè)的表皮若干片，每片約1 cm2大小，置于加入6 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH=6.8）的注射器中（規(guī)格為25 mL），抽真空促使其下沉。

2）TritonX-100 處理。 將下沉的洋蔥鱗莖表皮轉(zhuǎn)移至加入2 mL 1% TritonX-100 的燒杯中 （規(guī)格為50 mL）處理15 min；除去TritonX-100，用M緩沖液洗3 次，每次5 min。

3）固定。 用3%戊二醛固定30 min；除去固定劑，用磷酸鹽緩沖液輕輕清洗3 次，每次5 min。

4)染色。用0.2%考馬斯亮藍R250 染色30 min。

5）制片、鏡檢。 用蒸餾水輕輕沖洗2 次，然后將樣品置于載玻片上，加蓋玻片，在普通光學顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

1）選擇洋蔥時，用手輕輕按壓洋蔥，選擇包卷度緊密、緊實度較高的個體，這樣的材料較為新鮮。

2）用TritonX-100 處理細胞，抽提15 min 效果較為理想。若處理時間太短，沒有抽提掉無關(guān)蛋白和脂質(zhì)，則細胞呈很深的背景顏色，看不清細胞骨架的纖維網(wǎng)絡(luò)；若處理時間過長，則會破壞細胞骨架，使纖維網(wǎng)絡(luò)斷裂，影響細胞骨架觀察。

3）考馬斯亮藍R250 染色30 min 效果較好。 若染色時間較短， 則洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞骨架大部分尚未染上色（圖1A，本文附圖見封四）；染色30 min，高倍鏡下可觀察到細胞骨架纖細、連貫性好且可見其廣泛分布于細胞內(nèi)，染色效果最佳（見圖1B）；若染色時間過長，則細胞背景總體著色較深，難以觀察細胞骨架（圖1C）。

3 結(jié)語

細胞骨架的制備及觀察是細胞生物學實驗教學中較經(jīng)典且重要的一個實驗。 多年實驗教學經(jīng)驗表明，按照實驗教材常用方法進行實驗，往往實驗效果不太理想， 實驗結(jié)果不清晰容易導致學生對細胞骨架相關(guān)理論知識的理解不夠深入。此外，由于本科生基礎(chǔ)實驗課的課時較為固定， 要求學生在一次實驗課（約3 學時）完成一個相對獨立完整的實驗內(nèi)容。 因此，通過對洋蔥新鮮程度、TritonX-100 的處理時間、 考馬斯亮藍R250 的染色時間等實驗環(huán)節(jié)進行優(yōu)化， 確保大部分學生能在既定時間內(nèi)圓滿完成實驗。本實驗經(jīng)多次摸索，取新鮮堅實的洋蔥撕取內(nèi)表皮， 用1%TritonX-100處理細胞，抽提15 min，0.2%考馬斯亮藍R250 染色30 min， 可快速有效地制備洋蔥細胞骨架，不僅提高了實驗教學質(zhì)量， 而且為學生將來獨立從事相關(guān)科學研究奠定了基礎(chǔ)。