張凌云 孫 娟 劉艷秋

（首都師范大學附屬回龍觀育新學校 北京 102208）

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國重要的經濟作物之一，在醫(yī)藥、農業(yè)病蟲害防治和保健等方面具有重要的應用價值［1-2］。 此外，煙草常被作為植物基因工程和分子生物學研究中重要的模式植物。 通過對煙草的遺傳轉化探究基因的功能及作用機理［3-4］，解析次生代謝產物的合成機制［5］等，其中煙草組織培養(yǎng)技術是上述研究的關鍵環(huán)節(jié)。 有關萘乙酸（NAA）和6-芐基氨基嘌呤（6-BA）誘導不同種植物組織分化出根和芽的研究較多［6-8］，而不同濃度的NAA、6-BA 和激動素（KT）對煙草離體葉片不定器官分化的研究較少。 詹虹等［9］研究發(fā)現(xiàn)，MS 培養(yǎng)基中添加0.5 mg／L NAA 和0.5 mg／L 6-BA， 煙草葉片的出芽率為100%；MS 培養(yǎng)基中添加1.0 mg／L NAA 和0.1 mg／L 6-BA， 葉片的出芽率為0。 李玉明等［10］研究發(fā)現(xiàn)，NAA 和6-BA濃度比為5∶1 時，可誘導煙草葉片生成不定根；兩者的濃度比為1∶5 時，可誘導葉片生成不定芽。 本實驗以普通煙草品種Wisconsin 38 為實驗材料，通過設計不同濃度、 不同比例的NAA、6-BA 和KT，研究它們對煙草離體葉片不定器官分化的影響，并篩選獲得適宜不定芽和不定根分化的培養(yǎng)基。研究結果為煙草的組織培養(yǎng)及煙草基因工程提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料 普通煙草品種Wisconsin 38（W38）的種子由中國農業(yè)大學農學院特用作物研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 煙草無菌苗的獲得 將普通煙草品種W38 的種子用2%次氯酸鈉表面消毒5 min，無菌水漂洗2～3 次后，接種于MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為（25±2）℃，每日16 h、2 200 lx 光照。

1.2.2 培養(yǎng)基的設計及配制 以MS 為基本培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)基的組成見表1，所有培養(yǎng)基中均添加30%蔗糖和0.8%的瓊脂。

表1 不同培養(yǎng)基的組成

1.2.3 煙草葉片不定芽和不定根的誘導與分化取生長30～40 天無菌煙草植株中上部的葉片，去除主脈和葉緣，切成1 cm2大小的葉盤，接種于不同組合的培養(yǎng)基（表1）中，在（25±2）℃，每日16 h、2 200 lx 光照條件下培養(yǎng)。每個處理為30 個外植體，2 次重復實驗。每周觀察、照相記錄。培養(yǎng)5 周后，統(tǒng)計出芽率和生根率。 根據2 次重復實驗的統(tǒng)計結果，計算平均出芽率和生根率。

2 結果與分析

2.1 煙草葉片不定芽分化適宜培養(yǎng)基的獲得煙草葉片接種培養(yǎng)于1～12 號培養(yǎng)基中， 葉片切口處均能形成愈傷組織（圖1、圖2）。 培養(yǎng)3 周后，葉片在1～5 號培養(yǎng)基上形成不定芽，其中1 號最多，2號次之，6～12 號培養(yǎng)基中的葉片沒有不定芽的形 成。 3～5 周 后，1 號、2 號、4 號 和5 號 培 養(yǎng) 基中的葉片全部有不定芽的形成， 其中1 號和2 號中每個葉片平均出芽數均大于15 個芽，2 號培養(yǎng)基中不定芽生長迅速，已形成較大的葉片（圖1、圖2、表2）。因此，在MS 培養(yǎng)基中添加0.1 mg／L NAA 和0.25 mg／L 6-BA 的2 號培養(yǎng)基為適宜煙草離體葉片不定芽分化的培養(yǎng)基。

2.2 煙草葉片不定根分化適宜培養(yǎng)基的獲得由圖1 和圖2 可以看出，培養(yǎng)3 周后，3 號、6 號、9 號、11 號和12 號培養(yǎng)基中的葉片有不定根的形成，其中12 號最多，11 號次之，其他培養(yǎng)基中的葉片沒有不定根的形成。 3～5 周后，9 號、11 號和12 號培養(yǎng)基中的葉片全部有不定根的形成， 其中12 號培養(yǎng)基中每個葉片的出根數最多，9 號次之（圖1、圖2、表2）。 因此，12 號培養(yǎng)基為煙草離體葉片不定根分化適宜的培養(yǎng)基，即在MS 培養(yǎng)基中添加1.0 mg／L NAA 和0.1 mg／L KT。

2.3 不同濃度NAA、6-BA 和KT 對煙草葉片不定器官分化的影響 在含有0.1 mg／L NAA 的1～6 號培養(yǎng)基中， 煙草離體葉片出芽率普遍高于其他培養(yǎng)基（表2）。 其中，6-BA 或KT 與NAA 濃度的比值為10∶1 和5∶2 時，出芽率均為100%。 隨著6-BA 或KT 濃度的降低，出芽率降低，而生根率增加。其中，離體葉片在添加0.1 mg／L KT 培養(yǎng)基（6 號）中的出芽率顯著低于在添加相應濃度6-BA 培養(yǎng)基（3 號）中的出芽率。 由此可知，6-BA比KT 更易于誘導葉片不定芽。

在含有1.0 mg／L NAA 的7～12 號培養(yǎng)基中，離體葉片生根率普遍高于其他培養(yǎng)基（表2）。 其中，6-BA 或KT 與NAA 濃度的比值為1∶10 時，生根率均為100%， 隨著6-BA 或KT 濃度的升高，生根率降低，而出芽率增加。 其中，離體葉片在添加1.0 mg／L 6-BA 培養(yǎng)基（7 號）中的生根率為0，顯著低于在添加相應濃度KT 培養(yǎng)基（10 號）中的生根率。結果顯示，較高濃度的6-BA 能影響不定根的分化。

圖1 煙草葉片在添加0.1 mg／L NAA 和不同濃度6-BA 或KT 的MS 培養(yǎng)基中的分化情況

圖2 煙草葉片在添加1.0 mg／L NAA 和不同濃度6-BA 或KT 的MS 培養(yǎng)基中的分化情況

3 討論

激素是植物組織培養(yǎng)中器官分化的關鍵因素。 生長素常用于誘導愈傷組織的形成和根的分化，細胞分裂素的主要生理作用是促進細胞分裂、誘導芽的形成、促進芽的生長［11］。 本實驗結果顯示，6-BA 或KT 與NAA 濃度的比值為10∶1 和5∶2時，出芽率均為100%。 6-BA 或KT 與NAA 濃度的比值為1∶10 時， 生根率均為100%。 低濃度的NAA 與較高濃度的6-BA 或KT 組合可促進煙草離體葉片不定芽的分化，較高濃度的NAA 與低濃度的6-BA 或KT 組合可促進根的形成，這與前人［10］的結果一致。 進一步分析發(fā)現(xiàn)，當NAA 濃度一定時，培養(yǎng)基中添加6-BA 比KT 更易于誘導煙草葉片分化不定芽。

研究還發(fā)現(xiàn)， 雖然3 號、6 號、7 號和10 號培養(yǎng)基的NAA 與6-BA 或KT 的濃度比均為1∶1，但是它們的離體葉片出芽率和生根率卻不同。 3 號與7 號培養(yǎng)基相比，NAA 和6-BA 的濃度分別由0.1 mg／L 增加到1.0 mg／L，出芽率和生根率分別為78.34%和95%，68.34%和0。 結果顯示， 隨著NAA 和6-BA 濃度的增加， 離體葉片不定根的分化被強烈的抑制。 6 號和10 號中， 隨著NAA 與KT 濃度的增加，出芽率和生根率也隨之升高。 因此，NAA、6-BA 和KT 的濃度是煙草離體葉片不定器官分化的影響因素。 本實驗與前人［9］的研究結果不盡相同，可能是由于煙草品種不同、選取的葉片外植體生理狀態(tài)不同等因素， 使得離體培養(yǎng)的葉片對生長調節(jié)劑的敏感性不同， 從而影響不定器官的分化。

表2 不同生長調節(jié)劑對煙草離體葉片不定芽和不定根的影響

致謝： 本研究的實驗內容在中國農業(yè)大學農學院特用作物研究中心完成，在此致謝！