劉九榕 邵博文 周宇石 劉慧敏 闞 碩 薄鵬飛 張 凡**

（1 東營(yíng)市第一中學(xué) 山東東營(yíng) 257091 2 山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東濟(jì)南 250014）

德國(guó)小蠊（Blattella germanica）是常見(jiàn)的世界性室內(nèi)衛(wèi)生害蟲(chóng)之一，能攜帶多種病原微生物，其死亡蟲(chóng)體和分泌物還是引發(fā)人類哮喘、 鼻炎的重要過(guò)敏原［1-2］。 目前，德國(guó)小蠊的防治仍以化學(xué)防治為主，但化學(xué)殺蟲(chóng)劑存在危害人體健康、環(huán)境污染和抗藥性頻發(fā)等諸多問(wèn)題，相比于化學(xué)防治，生物防治發(fā)展前景更為廣闊， 研究和開(kāi)發(fā)新型德國(guó)小蠊生防制劑迫在眉睫。

粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）是一種廣泛存在于自然界中的革蘭氏陰性菌， 在害蟲(chóng)防治方面具有極大潛力，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于鱗翅目、直翅目、同翅目和鞘翅目昆蟲(chóng)的防治中［3-6］。 馮書(shū)亮等［7］分離得到的粘質(zhì)沙雷氏菌HBZBS21 菌株對(duì)黃脛小車蝗（Oedaleus infernalis）有很高的殺蟲(chóng)毒力，6.2×106CFU/mL 濃度菌懸液4 d 殺滅率可達(dá)80%以上。 粘質(zhì)沙雷氏菌能有效地控制昆蟲(chóng)種群數(shù)量增長(zhǎng)，ps-1 菌株處理過(guò)的甜菜夜蛾存活率和產(chǎn)卵率明顯低于對(duì)照組， 種群的增長(zhǎng)比對(duì)照降低了74.4%～100%［8］。

本研究自中華真地鱉蟲(chóng)尸上分離得到一株粘質(zhì)沙雷氏菌， 并進(jìn)一步評(píng)估了該菌株對(duì)各齡期德國(guó)小蠊的殺蟲(chóng)效果， 為研究開(kāi)發(fā)新型德國(guó)小蠊生防制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

生物材料： 德國(guó)小蠊均來(lái)自山東師范大學(xué)動(dòng)物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，未接觸任何化學(xué)和生物藥物，遺傳背景單一；飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（28±2）℃，相對(duì)濕度（60±5）%，光照時(shí)間為12 L∶12 D，采用小鼠全價(jià)飼料飼喂，飲水為自來(lái)水；粘質(zhì)沙雷氏菌（EB0732）分離自患病死亡的中華真地鱉（Eupolyphaga sinensis Walker）蟲(chóng)尸，現(xiàn)保藏于山東師范大學(xué)動(dòng)物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

試劑： 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（Tiangen公司）；生化反應(yīng)管（青島海博生物技術(shù)有限公司）。

儀器： MLR-351H 型昆蟲(chóng)培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；YXQ-LS-50S11 型高壓滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；MyGeneTM 系列精品型PCR 儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司）；Hitachi冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡Regulus8100（天美中國(guó)科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 形態(tài)觀察

菌落形態(tài)觀察： 將分離的菌株接種到LB 培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h 后觀察生長(zhǎng)情況及菌落特征。

細(xì)胞顯微形態(tài)觀察：掃描電鏡標(biāo)本采用臨界點(diǎn)干燥標(biāo)本，制備方法參照林加涵等［9］。 采用Hitachi RS8100 掃描電鏡在1.0 kV 加速電壓下觀察。

1.3 菌株理化性質(zhì)測(cè)定 將分離的菌株接種至LB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h 后， 接種至單個(gè)生化反應(yīng)管，生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行比對(duì)。

1.4 菌株16S rDNA 序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將供試菌株接種至LB 培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24 h后， 參照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒步驟提取DNA。 使用細(xì)菌16S rDNA 通用引物（1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′；27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物回收委托華大基因公司測(cè)序。運(yùn)用ClustalW 對(duì)所測(cè)得的16S rDNA 序列與從GenBank 中通過(guò)BLAST 檢索獲得的參考序列進(jìn)行多重對(duì)位排比，MEGA5.0 分析對(duì)比結(jié)果，運(yùn)用N-J Tree 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 菌株毒力測(cè)定 選取德國(guó)小蠊1～3 齡若蟲(chóng)，4～5 齡若蟲(chóng)，6～7 齡雌、雄若蟲(chóng)和雌、雄成蟲(chóng)各60 只，每組20 只試蟲(chóng)，設(shè)置3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，饑餓24 h 供試。 配制5 個(gè)濃度（1×105CFU／mL、1×106CFU／mL、1×107CFU／mL、1×108CFU／mL、1×109CFU／mL）的EB0732 菌懸液。 實(shí)驗(yàn)組飼喂2 μL 菌懸液，對(duì)照組飼喂2 μL 無(wú)菌水，記錄20 d 累計(jì)死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)觀察 EB0732 菌株在LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h 后，菌落呈紫紅色，光滑、濕潤(rùn)，表面呈金屬光澤，邊緣整齊或不整齊，有輕微異味（圖1A）。鏡檢結(jié)果可以看出菌體兩端鈍圓，桿狀，無(wú)芽孢，邊緣整齊光滑，長(zhǎng)0.81～1.56 μm，直徑0.48～0.69 μm（圖1B）。

德國(guó)小蠊感染后表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩， 少食甚至不食，糞便呈現(xiàn)紅色。 蟲(chóng)體死亡后呈暗紅色，逐漸變軟、變成紅色或發(fā)黑，伸直或皺縮，蟲(chóng)體破壞后有紅色菌膿流出，分離到大量EB0732 菌株，證實(shí)德國(guó)小蠊因EB0732 菌株感染致死， 正常蟲(chóng)體與死亡蟲(chóng)體對(duì)比見(jiàn)圖1C。

圖1 EB0732 菌體的形態(tài)及德國(guó)小蠊正常與死亡蟲(chóng)體對(duì)比

2.2 菌株鑒定 根據(jù)菌體形態(tài)特征、部分生理生化特征（表1）參考伯杰氏手冊(cè)，將EB0732 初步鑒定為沙雷氏菌屬。

表1 EB0732 菌株生理生化指標(biāo)

EB0732 菌株的16S rDNA 序列PCR 擴(kuò)增片段為1 230 bp，選取質(zhì)量較高的700 bp 片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建， 該片段在GenBank 中的登錄號(hào)為MH780739。 根據(jù)序列同源性比對(duì)結(jié)果，在NCBI 中選取6 個(gè)同源性較高的模式菌， 選取肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae R6）作為外類群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明EB0732 與粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens N2、Serratia marcescens VGH107 和Serratia marcescens LCT-SM166） 形成一個(gè)簇群，同源性為100。 結(jié)合生理生化指標(biāo)，將EB0732 菌株鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（圖2）。

圖2 基于16S rDNA 序列粘質(zhì)沙雷氏菌EB0732 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（N-J Tree）

2.3 菌株的毒力測(cè)定 試毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株毒力較強(qiáng)，菌懸液濃度與德國(guó)小蠊的死亡率成正相關(guān)，蟲(chóng)齡與死亡率呈負(fù)相關(guān)，但該菌株對(duì)雌、雄蟲(chóng)的毒力不存在顯著差異（具體結(jié)果可見(jiàn)表2，P＞0.05）。

3 討論

EB0732 菌株侵染德國(guó)小蠊后，蟲(chóng)體呈現(xiàn)相似癥狀， 死亡蟲(chóng)體中可再次分離獲得該菌株， 證實(shí)EB0732 為德國(guó)小蠊致病菌株，是潛在的生防菌。

生理生化指標(biāo)結(jié)果常存在偏差， 但運(yùn)用16S rDNA 序列同源性分析的方法能準(zhǔn)確地將未知菌鑒定到種水平，彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足。本研究通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)合16S rDNA 序列同源性分析，將病原菌株EB0732 鑒定為腸桿菌科， 沙雷氏菌屬的粘質(zhì)沙雷氏菌。據(jù)報(bào)道，粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)棉鈴蟲(chóng)、 菜青蟲(chóng)和甜菜夜蛾等常見(jiàn)鱗翅目害蟲(chóng)有較強(qiáng)致病力，田間噴灑菌液24 h 后，昆蟲(chóng)會(huì)出現(xiàn)不同程度的行動(dòng)遲緩，停食和蟲(chóng)口明顯減退等現(xiàn)象［10］，但該菌在蜚蠊目中的應(yīng)用尚未有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)首次自中華真地鱉蟲(chóng)尸分離出該菌，并評(píng)估了它對(duì)德國(guó)小蠊的殺滅效果，為德國(guó)小蠊的防治提供了新思路。

表2 粘質(zhì)沙雷氏菌EB0732 菌株20 d 累積死亡率（%）

毒力測(cè)定顯示EB0732 菌株對(duì)德國(guó)小蠊有較強(qiáng)毒力，1×109CFU/mL 的EB0732 菌株作用于1～3齡德國(guó)小蠊若蟲(chóng)時(shí)，20 d 累計(jì)殺滅率達(dá)87.50%。該菌株對(duì)于不同蟲(chóng)齡的德國(guó)小蠊毒力差異顯著，死亡率隨蟲(chóng)齡增長(zhǎng)遞減。一方面，這可能與若蟲(chóng)存在蛻皮期有關(guān)，在宿主昆蟲(chóng)若蟲(chóng)蛻皮期，腸管壁較薄弱，昆蟲(chóng)病原菌更易侵入昆蟲(chóng)血腔，引起昆蟲(chóng)患敗血癥死亡；另一方面，不同發(fā)育階段雖具有相似的免疫基因組成， 但蟲(chóng)齡小的昆蟲(chóng)免疫基因的表達(dá)不完善，如微粒體多功能氧化酶（MFO）、細(xì)胞色素P450 氧化酶、乙酰膽堿酯酶和酚氧化酶等解毒酶的選擇性表達(dá)［11-12］，這暗示了該菌株用以防治德國(guó)小蠊的最佳時(shí)期為若蟲(chóng)期。 此外，總體來(lái)看，該菌株對(duì)雌、雄蟲(chóng)的毒力沒(méi)有顯著性差異，但雄性略高于雌性，這可能與雌性體重更大，免疫防御機(jī)制更完善有關(guān)［12-13］。

粘質(zhì)沙雷氏菌可通過(guò)產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、 磷脂酶、靈菌紅素等次級(jí)代謝產(chǎn)物，水解昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)體表和圍食膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸道微絨毛變形甚至脫落，影響昆蟲(chóng)腸道對(duì)病原微生物的抵御和營(yíng)養(yǎng)攝取等正常生命活動(dòng)［14-16］。經(jīng)初步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該沙雷氏菌株單劑毒力相對(duì)較弱， 下一步可采用該菌株與化學(xué)殺蟲(chóng)劑、病原真菌等科學(xué)復(fù)配以增強(qiáng)其生防效果。 各組分殺蟲(chóng)機(jī)理和作用方式均不相同， 可從破壞蟲(chóng)體免疫、神經(jīng)系統(tǒng)以及營(yíng)養(yǎng)消耗等多方面產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而加速蟲(chóng)體的死亡，產(chǎn)生更好的殺滅效果。