張 立 陶若婷 張雁云 范六民 戴俊彪

（1 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100875 2 北京十一學(xué)校 北京 110000 3 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100871 4 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 北京 100084）

總分：100 分 時(shí)間：90 min

這場考試中， 你將同時(shí)為2 個(gè)目的完成一項(xiàng)PCR-RFLP 實(shí)驗(yàn)。

·鑒定分析藥物代謝酶（NAT2）的基因型，以決定肺結(jié)核（TB）治療藥物口服的劑量。

·未知身份活檢樣本的法醫(yī)鑒定。

實(shí)驗(yàn)包括5 個(gè)任務(wù)：

·任務(wù)1：設(shè)計(jì)RFLP 實(shí)驗(yàn)（17 分）

·任務(wù)2：完成RFLP 實(shí)驗(yàn)的操作（44 分）

（注意： 電泳實(shí)驗(yàn)必須距考試開始75 min 內(nèi)開始。 75 min 后，將不允許跑膠）

·任務(wù)3：法醫(yī)鑒定未知身份的活檢樣本（9 分）

·任務(wù)4：解讀患者基因型（12 分）

·任務(wù)5：根據(jù)患者基因型確定藥物用量(18 分)請(qǐng)注意以下事項(xiàng)：

·切記，請(qǐng)用鉛筆清楚填寫學(xué)生代碼，務(wù)必填寫在答題卡第1 頁要求的框內(nèi)。

·在答題卡上答題（用鉛筆和橡皮擦）。 只有答題紙上的答案才有效。

·請(qǐng)確保您在考試開始時(shí)已收到列出的所有材料和儀器。如果材料不全，請(qǐng)立即舉紅牌示意實(shí)驗(yàn)室助理。

·在實(shí)驗(yàn)過程中，請(qǐng)正確使用儀器。任何溢灑的化學(xué)品或打碎的儀器都不會(huì)補(bǔ)充。但是，如果任何設(shè)備出現(xiàn)故障， 請(qǐng)舉起紅牌。 實(shí)驗(yàn)室助理會(huì)幫忙，必要時(shí)更換一個(gè)新設(shè)備。

材料和設(shè)備

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所有實(shí)驗(yàn)室都提供包括計(jì)算器、鉛筆（2B）、橡皮擦和直尺在內(nèi)的其他工具。

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任務(wù)1 PCR-RFLP 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（17 分）

前言

異煙肼（INH）是治療結(jié)核?。═B）的重要藥劑。盡管該療法療效顯著，但仍有治療失?。o效的治療）和難以處理的副作用（最常見的是肝損傷和有時(shí)致死）。 INH 乙?；徽J(rèn)為是導(dǎo)致藥物引起肝中毒的主要原因。圖1 提供了非誘導(dǎo)肝酶芳香胺的N-乙?；D(zhuǎn)移酶2 型（NAT2）催化INH 乙?；闹饕緩?。 每個(gè)個(gè)體乙酰化速率恒定，但不同患者的速率不同。 人類群體可根據(jù)乙酰化速率分為3 個(gè)不同的表型組：慢、中、快乙?；?。NAT2 慢乙?；颊弑籌NH 誘導(dǎo)的肝中毒發(fā)病率更高。 相反，快乙?；颊呓M中更容易發(fā)生治療失敗。 通常，快乙?；M人群的基因型在3 個(gè)位置［NAT2*4（C481，G590，G857）］的SNP 都是純合野生型。 中乙?；巳菏请s合子，在一個(gè)位置有單個(gè)SNP 的突變，即3個(gè) 位 置 中 的 一 個(gè)NAT2*5 （C481T）、NAT2*6（C590A）或NAT2*7 （G857A）（見圖2a 和2b）。 慢乙?；巳簞t有不止一個(gè)等位基因突變（可以是一個(gè)位置的2 個(gè)等位基因，或多個(gè)位置的突變）。

圖1 NAT2（N 乙酰基轉(zhuǎn)移酶）催化的INH 代謝

NAT2 基因型可以通過等位基因特異的聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)實(shí)驗(yàn)測定。

接受相同劑量的INH 的不同NAT2 基因型患者血液INH 濃度的分析表明，慢乙?；私M的血清中INH 的濃度比快和中乙酰化組高2～7 倍。 因此，NAT2 基因分型，可以幫助實(shí)現(xiàn)INH 劑量使用的個(gè)性化。

在本實(shí)驗(yàn)中， 你將收到從3 個(gè)結(jié)核病患者P1、P2 和P3 全基因組DNA 中提取的NAT2 基因的PCR 產(chǎn)物，以及從這3 個(gè)患者提取的未標(biāo)明的活檢標(biāo)本PCR 產(chǎn)物X、Y 和Z。你需要設(shè)計(jì)和實(shí)施PCR-RFLP 實(shí)驗(yàn)， 以確定每個(gè)患者的NAT2 基因型，并且鑒定其活檢標(biāo)本。 在PCR 產(chǎn)物上，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶（RE）鑒定基因型。 用所獲得的數(shù)據(jù)，確定活檢X、Y 和Z 的身份。 最后，確定患者P1、P2 和P3 最適宜的INH 劑量。

圖2（a）

在答題卡上的圖中完成期望的RFLP 結(jié)果模式（pattern），請(qǐng)用鉛筆作答，畫出4 個(gè)NAT2 等位基因NAT2*4 （野生型），NAT2*5（481T），NAT2*6（590A）和NAT2*7（857A）限制性酶切完全消化PCR 產(chǎn)物所期望產(chǎn)生的條帶。 雜合子的例子已經(jīng)提供。

圖Q1.1

本項(xiàng)任務(wù)中， 你需要進(jìn)行共12 管樣本的RFLP 反應(yīng)，鑒定3 位患 者（P1、P2、P3）和3 個(gè)活體樣本 （X、Y、Z） 的野生型、NAT2*5 等位基因（標(biāo)為a）、NAT2*7 等位基因（標(biāo)為b）。 請(qǐng)?jiān)诿總€(gè)PCR 管中，使用7.0 μg DNA，限制性緩沖溶液，需要使用RE 時(shí)使用l.0 μL。

問題1.2 （5 分）

請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)患者（P1～P3）和樣本（X～Z）的限制性消化或者NAT2 基因型分析，在l0 μL 的體系中。請(qǐng)?jiān)诖痤}卡上完成下表。

表Q1.2

任務(wù)2 完成RFLP 實(shí)驗(yàn)操作（44 分）

注意：

·電泳時(shí)，你只操作使用FlashGel 系統(tǒng)的2 個(gè)部件，膠盒（Cassette）和電泳槽（Dock）（圖3），而電源和攝像機(jī)由實(shí)驗(yàn)室助理操作。 為達(dá)到最佳效果，加樣前，用去離子水先沖洗加樣槽。 觀察條帶時(shí)，關(guān)燈（用電泳槽Dock 上的開關(guān)），并戴護(hù)目鏡。

·你可以再要一塊膠，但是會(huì)罰去20 分。

·使用加樣槍加樣前， 用離心機(jī)短時(shí)間離心所有試劑 （務(wù)必在對(duì)側(cè)放置相應(yīng)離心管以平衡離心機(jī)，如果只有一個(gè)管，用空管平衡）。

圖3 FlashGel［8］水平電泳系統(tǒng)（A）膠盒Cassette（B）膠槽Dock（C）照明開關(guān)（D）相機(jī)（E）電源

該實(shí)驗(yàn)過程包括2 個(gè)階段：PCR-RFLP 消化和電泳。

第1 步（準(zhǔn)備RE 消化的離心管）：用細(xì)尖記號(hào)筆將12 個(gè)微管（Microtube）標(biāo)記為P1a，P1b，P2a，P2b，P3a，P3b，Xa，Xb，Ya，Yb，Za，Zb，對(duì)應(yīng)于3 名患者（P1，P2 和P3）和3 個(gè)活檢樣本用Kpn I 或者Bam HI 消化后的基因組DNA 的PCR 產(chǎn)物。

第2 步（限制性酶消化混合物的制備）：根據(jù)你設(shè)計(jì)的限制性酶消化反應(yīng)（你答題卡上的表Q1.2），在步驟1 標(biāo)記你的微管中制備限制性酶消化的混合物。用加樣槍在管中輕輕吸加樣本進(jìn)行攪拌，或者用手指輕彈管底。制備混合物時(shí)，切勿污染樣品（每次操作使用一個(gè)新槍頭）。 用適合的適配器離心沉降樣品（離心前請(qǐng)平衡離心管）。 制備過程中和離心后，請(qǐng)總是將離心管置于冰上。

第3 步（溫育消化反應(yīng)，準(zhǔn)備預(yù)制凝膠）：所有的離心管都準(zhǔn)備好后，從冰中取出，置于你顏色編碼的泡沫浮架上，在指定給你的37℃水浴中（位于座位后面）孵育5 min。孵育5 min 后，請(qǐng)務(wù)必取回自己的樣本。

在37℃孵育時(shí)， 你可以準(zhǔn)備之前參觀實(shí)驗(yàn)室時(shí)看過的膠塊（預(yù)制凝膠），步驟如下：

·用剪刀剪開包裝的一側(cè)，小心取出膠塊。

·取出膠塊的白色封條（但不要移除側(cè)面的透明封口）。

·用洗瓶使用去離子水沖洗加樣孔（務(wù)必沖洗所有加樣孔）， 傾斜膠塊， 排去多余液體，用Kimwipe 紙吸去多余液體（不要直接吸加樣孔）。

·將膠塊加入電泳槽（如果需要幫助，請(qǐng)舉起紅卡）后可以準(zhǔn)備上樣。

第4 步（RE 滅活，停止消化反應(yīng)）：5 min 的限制性酶消化結(jié)束后，取回自己的離心管，將其移至附近的80℃加熱裝置（如有必要，用紙巾吸干微管外多余的液體）孵育5 min。

第5 步（DNA／PCR-RFLP 產(chǎn)物染色）：經(jīng)過80℃的孵育后，離心冷卻，并將試劑離心至管底。在每個(gè)離心管中加入2.5 μL DNA 染色染料（標(biāo)記為D）。充分混合,然后再次使用微型離心機(jī)輕微離心一次。

第6 步（電泳上樣）：12 個(gè)樣品（P1a - Zb）和100 bp ladder 溶液（標(biāo)記M）分別上樣5 μL（注意：每個(gè)泳道體積上限是5 μL，上樣不要超過5 μL）。 請(qǐng)務(wù)必將槍頭小心置于加樣孔上方，輕輕加入樣品，不要灑出。 請(qǐng)嚴(yán)格按照以下順序，依次加入樣品至各泳道（從左側(cè)開始，加樣孔在離你遠(yuǎn)的那端）。

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第7 步（運(yùn)行電泳）：加樣完成后，舉起綠卡。實(shí)驗(yàn)室助手將啟動(dòng)電泳。 電源的電壓應(yīng)設(shè)為200 V。大約7～8 min （當(dāng)Ladder M 最快的條帶已經(jīng)跑過凝膠2/3 處）后，再次舉起綠卡，通知助手?jǐn)嚅_（關(guān)閉）電源。

第8 步（記錄凝膠數(shù)據(jù)）：助手將電泳槽從電源盒斷開。 電泳槽插上電源插座，將燈打開。 觀察凝膠（帶護(hù)目鏡），并用鉛筆在答題卡的圖Q2.1 上畫出觀察到的各條帶 （注意打印好的ladder M的標(biāo)度， 畫出的任何和下一步將制備的膠照片不匹配的泳道或條帶都不能得分）。

第9 步（拍攝凝膠）：完成繪圖后，在標(biāo)簽貼紙上標(biāo)明自己的學(xué)生號(hào)（Student ID），附在你膠塊的框上（紅色的部分）。 舉起綠卡，將帶膠塊的電泳槽交給實(shí)驗(yàn)室助理。助理將會(huì)為凝膠拍照，并將照片附于你答題卡上（注意，沒有按照第6 步中順序加樣的結(jié)果將不計(jì)分，但是可以用于后面的題）。

問題2.1 畫出凝膠圖。 （18 分）

問題2.2 將照片貼在答題卡上（26 分）

任務(wù)3 活檢樣品的法醫(yī)鑒定（9 分）

問題3.1 （9 分）

根據(jù)任務(wù)2 中3 個(gè)患者（P1～P3）樣品，和3個(gè)活檢標(biāo)本的PCR-RFLP 譜， 對(duì)比匹配樣本X、Y、Z 分屬哪位患者，在答題卡的表格中填入答案。

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注意：任務(wù)4 和任務(wù)5 答題時(shí)，如果你未能在任務(wù)2 中成功分析出患者P1、P2、P3 的基因型，你可以根據(jù)活體標(biāo)本（X、Y、Z）的結(jié)果譜進(jìn)行推測，在要求填入“患者”的欄目填入X、Y、Z，但是每次替代都會(huì)被扣除1.5 分。

任務(wù)4 患者的基因型解讀（12 分）

問題4.1 （9 分）

根據(jù)你Kpn I（NAT2*5 或C481T）和Bam HI（NAT2*7 或G857A）消化后，PCR-RFLP 的結(jié)果，推斷3 名患者的基因型， 在答題卡上填寫完成表格。 基于TaqⅠ消化后NAT2*6（G590A）位點(diǎn)3名患者的基因型已經(jīng)給出。

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問題4.2 （3 分）

基于你對(duì)3 名患者基因型的判斷（問題4.1），推斷他們乙?；谋硇?， 請(qǐng)?jiān)诖痤}卡上相應(yīng)方塊內(nèi)打勾（√）。

A.患者P1 B.患者P2 C.患者P3

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任務(wù)5 根據(jù)患者基因型決定用藥劑量（18 分）

前言：2015 年，Jung A J 和他同事 （Journal of Drug Design，Development and Therapy；9：5433-8）研究了206 例接受標(biāo)準(zhǔn)劑量INH 治療 （5 mg/kg 體重，通常每天用藥300 mg INH）的肺結(jié)核患者，發(fā)現(xiàn)在快乙?；颊哂盟幒? h 血清中，INH 含量顯著低于慢乙?；M。 包含年齡、 性別、 體重和NAT2 基因型的多重線性回歸分析表明，NAT2 和體重獨(dú)立影響INH 濃度（P＜0.001），而其他因素不影響INH 濃度（P＞0.05）。

根據(jù)回歸分析，INH 濃度的最佳預(yù)測公式如下：

血 清INH 濃 度（mg/L）=13.821-0.1×（體 重，kg）-2.273×（高活性NAT2 等位基因的數(shù)量，0，1，2）（公式1）

在此公式中， 高活性NAT2 等位基因的數(shù)量（0，1，2），分別相應(yīng)于3 種表型，即慢、中和快乙酰化者。

INH 最有效的抗結(jié)核治療，是用藥2 h 后，血清中INH 濃度降至3.0～6.0 mg/L 的范圍內(nèi)。 根據(jù)圖4中藥物標(biāo)簽上顯示的INH 的濃度， 請(qǐng)判定適合于P1、P2、P3 3 位患者的處方。根據(jù)下面2 個(gè)步驟作答（問題5.1 和5.2）。 假設(shè)3 名患者體重都是70 kg。

問題5.1 （6 分）

假設(shè)， 每名患者服用300 mg INH 的日劑量，根據(jù)公式1 和患者的基因型估算用藥2 h 后P1、P2、P3 血清中INH 的濃度。 完成答題卡上的表格（結(jié)果保留3 位小數(shù)）。

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問題5.2 （12 分）

請(qǐng)根據(jù)每位患者相應(yīng)的NAT2 基因型， 決定他們每天最少需要吃多少片藥（見圖4），以保證抗肺結(jié)核治療的最佳效果。 填寫完成答題卡上的表格（請(qǐng)?zhí)顚懻麛?shù)）。

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（待續(xù)）