張寧媛，孫海翔

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，南京 210008)

胚胎體外培養(yǎng)的目的是保持胚胎的發(fā)育質(zhì)量，增加成功分娩健康嬰兒的機(jī)會。培養(yǎng)液是胚胎體外發(fā)育的能量補(bǔ)給站，培養(yǎng)液成份的改進(jìn)，維持甚至改善了胚胎在體外培養(yǎng)期間的發(fā)育潛能。胚胎體外培養(yǎng)的主要目標(biāo)是盡可能滿足植入前胚胎發(fā)育的要求。胚胎在體外條件下，需要不斷適應(yīng)微環(huán)境的變化。在有效培養(yǎng)系統(tǒng)下，小鼠胚胎在體外獲得了與體內(nèi)相似的發(fā)育速度與質(zhì)量[1]?，F(xiàn)有商品化培養(yǎng)液，能保持胚胎較好的體外發(fā)育能力。本文闡述了胚胎培養(yǎng)液的設(shè)計策略、培養(yǎng)液的能量代謝與pH緩沖的需求及研究結(jié)果，以期優(yōu)化培養(yǎng)液使用策略，促進(jìn)胚胎發(fā)育。

一、培養(yǎng)液設(shè)計策略

卵裂期胚胎通常在輸卵管中發(fā)育至囊胚后進(jìn)入子宮腔。在人類子宮中，胚胎發(fā)育的主要能量物質(zhì)(丙酮酸、乳酸或葡萄糖)的濃度，在整個月經(jīng)周期中幾乎沒有變化。子宮液中的丙酮酸濃度(0.1 mmol/L)明顯低于卵泡期和月經(jīng)中期輸卵管液中的丙酮酸濃度(0.25 mmol/L和0.32 mmol/L)。子宮液中乳酸水平(5.87 mmol/L)也低于月經(jīng)中期輸卵管中的乳酸水平(10.50 mmol/L)。相反，子宮液中的葡萄糖濃度(3.15 mmol/L)明顯高于輸卵管中的葡萄糖濃度(0.50 mmol/L)[2]。這些觀察結(jié)果表明，胚胎從處于母體遺傳控制之下偏好丙酮酸，到胚胎基因組激活后轉(zhuǎn)移到葡萄糖代謝。囊胚期胚胎表現(xiàn)出更高的代謝需求。

依據(jù)著床前胚胎在不同發(fā)育階段對培養(yǎng)條件的特定需要，基于“回歸自然”的理念，設(shè)計出序貫培養(yǎng)液[3]。各種商品化的人類胚胎序貫培養(yǎng)液，都試圖模擬發(fā)育中的胚胎不斷變化的需要，盡可能接近自然環(huán)境。胚胎體外操作過程引起的細(xì)胞和代謝的應(yīng)激，胚胎被迫需要消耗能量來應(yīng)對這樣的外來環(huán)境變化；同時人們對輸卵管和子宮環(huán)境的認(rèn)識進(jìn)一步加深，也促進(jìn)了培養(yǎng)液成份的不斷改進(jìn)。

輸卵管對配子、受精和早期胚胎發(fā)育具有特異性和顯著性的影響。早期宮腔環(huán)境對胚胎發(fā)育也十分重要。人子宮液中氨基酸濃度為3.54 mmol/L。宮腔中檢測到的18種氨基酸的相對濃度不受年齡、體重指數(shù)、周期或特定良性婦科疾病的影響，但飲食習(xí)慣會影響氨基酸的相對濃度，健康飲食與非健康飲食的婦女的子宮液中，天冬酰胺、組氨酸、絲氨酸、谷氨酰胺、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸濃度存在差異[4]。

在動物胚胎體外培養(yǎng)過程中，為了盡可能接近生理條件下的培養(yǎng)環(huán)境，在培養(yǎng)液中添加生殖道液體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，精子上游液體中添加生殖道液體后，提高了豬卵的受精率；胚胎培養(yǎng)液中添加了生殖道液體后，提高了豬的囊胚質(zhì)量，囊胚的細(xì)胞數(shù)量增加、更易孵化。同時，培養(yǎng)過程添加了生殖道液體的胚胎，參與重編程、印跡和發(fā)育的基因受體外培養(yǎng)的影響較少，更接近體內(nèi)發(fā)育的胚胎[5]。

單一培養(yǎng)液不同于序貫培養(yǎng)液，將同一成份培養(yǎng)液覆蓋了從受精到囊胚的整個著床前胚胎的全程體外培養(yǎng)過程。其設(shè)計思路是“讓胚胎選擇”，即在培養(yǎng)液中，包括了所有濃度的混合物，而胚胎本身會適應(yīng)和利用它所需要的一切營養(yǎng)和能量，主動控制離子梯度等，并能調(diào)節(jié)其內(nèi)部環(huán)境。已有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)顯示，人類胚胎可以在單一培養(yǎng)液中連續(xù)培養(yǎng)至囊胚期，而不需要在48 h換液。單一培養(yǎng)液培養(yǎng)為胚胎提供了更穩(wěn)定的培養(yǎng)條件，胚胎的形態(tài)動力學(xué)參數(shù)也未受影響，可產(chǎn)生更多的優(yōu)質(zhì)胚胎[6-8]。

二、培養(yǎng)液的能量代謝

細(xì)胞的新陳代謝具有兩種功能：一是提供細(xì)胞維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)所需的能量，二是提供用于細(xì)胞生物合成的物質(zhì)。體外胚胎發(fā)育至囊胚的過程中，胚胎的能量代謝存在發(fā)育階段的特異性[9]。

總體上說，胚胎著床前，添加到胚胎培養(yǎng)液中的主要能量基質(zhì)有丙酮酸、乳酸和葡萄糖。早期階段，ATP(adenosine triphosphate，三磷酸腺苷)的代謝相對較低，ATP/ADP(adenosine diphosphate，二磷酸腺苷)比值較高，能量代謝的特點(diǎn)是消耗好氧底物，如丙酮酸、乳酸和谷氨酰胺，葡萄糖利用少。桑椹胚階段，代謝活動開始急劇上升，ATP/ADP比值下降，對能量的需求增加。細(xì)胞分裂的數(shù)量增加，蛋白質(zhì)的生物合成和與囊胚腔形成相關(guān)的離子泵作用，成為能量的主要消耗過程。早期的首選營養(yǎng)物質(zhì)丙酮酸鹽的吸收水平下降到非常低的水平，而葡萄糖的吸收水平上升。

具體情況是，在卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體中，卵母細(xì)胞強(qiáng)調(diào)糖酵解和磷酸戊糖(pentose phosphate pathway，PPP)途徑[10]。糖酵解通過己糖激酶的活性提供重要的能量來源。PPP為嘌呤的合成提供原料。己糖胺生物合成途徑對于卵丘細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)張十分重要。多羥基化合物途徑提供山梨醇和果糖作為其他能量來源，維持氧化還原平衡。卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的代謝也存在相互的作用。與卵丘細(xì)胞相比，卵母細(xì)胞缺乏糖酵解高效代謝葡萄糖、從醋酸酯合成膽固醇和直接攝取丙氨酸的能力。相反，卵母細(xì)胞從卵丘細(xì)胞中獲得糖酵解(如丙酮酸)和膽固醇生物合成(如膽固醇)途徑的產(chǎn)物以及丙氨酸。同時，卵母細(xì)胞分泌旁分泌因子來促進(jìn)這一過程。受精后，受精卵以丙酮酸、乳酸等三羧酸為主要能量來源[11]。卵裂期胚胎的代謝以丙酮酸、乳酸代謝為主、并以低水平氧化特定氨基酸為基礎(chǔ)。胚胎的代謝模式最初以丙酮酸為能量來源。當(dāng)胚胎發(fā)育到桑椹胚期以后，葡萄糖的消耗量急劇增加，從低糖利用轉(zhuǎn)化為高糖利用。小鼠囊胚中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)幾乎完全采用糖酵解方式，滋養(yǎng)細(xì)胞(Trophectoderm，TE)則消耗一半葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸。葡萄糖需求的增加，為囊腔的形成和維持提供了能量來源。囊胚腔的乳酸濃度比周圍環(huán)境更高。谷氨酰胺和脂質(zhì)可分別通過三羧酸循環(huán)或脂肪酸氧化，作為著床前胚胎發(fā)育各階段的能量來源。脂質(zhì)代謝在8細(xì)胞期之前保持相對穩(wěn)定，但在8細(xì)胞期和桑椹胚期之間突然增加。胚胎的平均耗氧量在第一次分裂時達(dá)到峰值，胚胎致密化后耗氧量下降到最低，然后逐漸增加到囊胚期[12]。囊胚中兩種細(xì)胞ICM和TE的代謝也有差異[13]。與TE相比，ICM細(xì)胞的代謝相對安靜。而TE比ICM包含更多的線粒體，比ICM消耗更多的氧，也產(chǎn)生更多的ATP。與ICM相比，TE產(chǎn)生囊胚中大約80%的ATP。TE產(chǎn)生能量的主要來源可能是位于TE基底外側(cè)膜上的Na+、K+ATPase(鈉泵酶)。

囊胚培養(yǎng)液中存在過量的乳酸鹽可能是造成胚胎應(yīng)激的一個因素。在對107名23～40歲之間的患者進(jìn)行的一項前瞻性同卵比對試驗(yàn)中，比較了使用低乳酸水平或高6倍乳酸水平的培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)在低乳酸培養(yǎng)液中培養(yǎng)的胚胎，妊娠和持續(xù)妊娠的比例更高，提示低乳酸培養(yǎng)液促進(jìn)人胚胎的體外發(fā)育[14]。兩個獨(dú)立的體外受精實(shí)驗(yàn)室分別使用序貫培養(yǎng)液(G-Series)或單一培養(yǎng)液(CSCM-NX)、單一培養(yǎng)液(CSCM)或單一培養(yǎng)液(CSCM-NX)，培養(yǎng)胚胎至囊胚期，檢測胚胎的非整倍體率，得出了一致的結(jié)論。由于CSCM-NX的乳酸濃度較低，通過簡單地改變培養(yǎng)液乳酸濃度，使用低乳酸濃度的單一培養(yǎng)液(CSCM-NX)培養(yǎng)的胚胎，整倍體胚胎數(shù)量增加了約10%[15]。這提示了培養(yǎng)液中過量的乳酸鹽，可能通過影響細(xì)胞的紡錘體組裝和染色體分離，改變胚胎發(fā)育和細(xì)胞完整性，增加有絲分裂過程中非整倍體的發(fā)生。

三、培養(yǎng)液的pH緩沖

體外胚胎培養(yǎng)需要細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，維持胞內(nèi)pH(pHi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育。動物實(shí)驗(yàn)中，胚胎培養(yǎng)液中添加弱酸DMO(5，5-二甲基-2，4-惡唑烷二酮)，結(jié)果顯示：無論是在受精卵向2細(xì)胞或者2細(xì)胞向8細(xì)胞分裂期間短時間添加，還是從受精卵持續(xù)到囊胚期的長時間添加，盡管囊胚發(fā)育和形態(tài)沒有改變，但均出現(xiàn)囊胚質(zhì)量下降，細(xì)胞數(shù)量減少而凋亡增加。第一次卵裂期間添加DMO，不改變種植結(jié)局，但胎鼠體重、冠臀長均明顯下降；而如果在整個著床前發(fā)育過程中持續(xù)暴露于DMO中，不但降低胚胎著床率，而且降低胎鼠體重和冠臀長度。由此可見，細(xì)胞內(nèi)pH值的輕微變化，可以顯著影響胚胎發(fā)育和生存能力，提示著床前小鼠胚胎對細(xì)胞內(nèi)pH高度敏感[16]。適當(dāng)而穩(wěn)定的培養(yǎng)液pH值，對維持胚胎持續(xù)發(fā)育的能力顯得至關(guān)重要。

pH值的平衡取決于化合物的結(jié)合或離解。維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，最重要的離子是鈉、鉀、鎂、氯和乳酸。在人類卵裂期胚胎中，細(xì)胞內(nèi)pH值為7.2。培養(yǎng)液的pH值主要通過培養(yǎng)箱提供的CO2濃度的平衡和培養(yǎng)液中碳酸氫鹽的濃度來調(diào)節(jié)[17]。升高CO2會降低培養(yǎng)基的pH值，反之則提高pH值。平衡的時間取決于CO2在介質(zhì)中的擴(kuò)散和反應(yīng)的時間[18]。介質(zhì)的體積、表面積、油層的使用等，都會影響氣體交換和平衡的時間。即使提供相同的CO2濃度、相同的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，在不同的實(shí)驗(yàn)室之間可能會產(chǎn)生不同的平衡時間。

在培養(yǎng)液中使用緩沖液有助于穩(wěn)定pH。不同的緩沖介質(zhì)，緩沖能力是有差異的。監(jiān)測碳酸氫鹽和HEPES兩種緩沖介質(zhì)的培養(yǎng)液的實(shí)時pH值時，可以發(fā)現(xiàn)，大氣環(huán)境下3 min后，碳酸氫鹽緩沖介質(zhì)的pH已經(jīng)超過7.4，而HEPES緩沖介質(zhì)在7.3左右可以穩(wěn)定10 min以上。與單獨(dú)添加NaHCO3比較，兩性離子緩沖顯著增加了緩沖能力[19]。最常用的緩沖液HEPES和MOPS，兩者的pKa值都是7.2，是兩性離子緩沖液中最接近于胚胎pH值的。其中MOPS在酸性范圍內(nèi)的pH緩沖稍好，而HEPES在堿性范圍內(nèi)的pH緩沖稍好。將這兩種廣泛使用的緩沖液以1∶1的比例(每一種10 mmol/L)結(jié)合起來使用，比相同濃度的單個緩沖液，增加了有效緩沖能力。與單獨(dú)使用20 mmol/L的MOPS或HEPES相比，將兩種緩沖液以1∶1的比例組合使用，緩沖范圍相似，允許pH在MOPS或HEPES之間緩沖。雙緩沖介質(zhì)(MOPS+HEPES)的培養(yǎng)液，有助于增強(qiáng)體外精子的存活能力。比較8 h與48 h兩個時間點(diǎn)，雙緩沖介質(zhì)與單緩沖介質(zhì)培養(yǎng)液中的精子參數(shù)，發(fā)現(xiàn)雙緩沖介質(zhì)中的精子活力更好、前向運(yùn)動精子的比例更多[20]。為了降低對胚胎的應(yīng)激以及可能的毒性反應(yīng)，只要維持適當(dāng)?shù)膒H穩(wěn)定和支持胚胎發(fā)育，應(yīng)盡可能減少緩沖介質(zhì)的濃度。

四、小結(jié)

胚胎培養(yǎng)液的總體設(shè)計策略，應(yīng)該是在胚胎體外發(fā)育時，通過提供底物，來引導(dǎo)胚胎采用相應(yīng)的代謝模式，利用內(nèi)源性營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)液是配子與后續(xù)胚胎體外發(fā)育相互作用的重要因素。作為人類胚胎生長的外部環(huán)境，培養(yǎng)液的設(shè)計是復(fù)雜的，需要選擇合適和必要的成分，盡量減少對胚胎的應(yīng)激。