吳正中，李雪梅*，劉蘭云，成艷君，王萍

(1.南方醫(yī)科大學附屬深圳婦幼保健院，深圳 518000；2.深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院，深圳 518000)

IVF-ET是臨床治療患者不孕不育的重要方法，其首要環(huán)節(jié)是利用超生理劑量的Gn進行控制性促排卵(COH)。獲得足夠數量和質量的卵母細胞是臨床IVF-ET治療取得成功的先決條件，而患者COH過程中對外源Gn刺激的反應性決定了臨床可獲得卵母細胞的數量和質量[1]。當前，患者COH過程中出現的卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟障礙是臨床應用IVF-ET技術不得不面對的常見難題。因此，如何優(yōu)化臨床COH方案，增強患者卵巢組織對外源Gn的反應性仍然是臨床亟待解決的重要課題。

現有的研究表明，在卵巢反應不良患者的COH過程中添加外源生長激素(GH)協(xié)同Gn作用，能明顯改善卵巢組織對外源Gn的反應性，促進卵泡募集，提高獲卵數和卵母細胞成熟度，并最終改善胚胎培養(yǎng)的結局[2]。但目前該方案對多囊卵巢綜合癥(PCOS)患者的有效性缺乏必要的研究支持。本研究通過觀察外源GH在COH過程中的輔助應用對PCOS患者卵母細胞發(fā)育成熟和體內相關激素與細胞因子分泌及特定基因表達的影響，揭示外源GH在COH過程中改善PCOS患者卵母細胞成熟度的應用價值及其初步機制。

資料和方法

一、研究對象及分組

選擇2016年9月至2019年1月在深圳市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心利用卵胞漿內單精子注射(ICSI)技術進行不孕治療的PCOS患者75例。根據患者促排卵過程中是否使用外源GH，將其分成兩組：使用GH組(44例)和未使用GH組(31例)。所有入選病例均滿足Rotterdam診斷標準(2003)[3]，排除有以下任何一種情況者：(1)有子宮內膜異位癥、甲狀腺功能減退癥、高泌乳素血癥、先天性腎上腺皮質增生癥或既往卵巢手術史等其他影響生育能力的疾?。?2)男女任何一方染色體異常。所有患者知情同意，并經本院醫(yī)學倫理委員會批準后啟動研究。

二、方法

1.促排方案：進入治療前一月經周期給予口服避孕藥，至服藥第15天開始用達菲林(0.05 mg/d，益普生，法國)皮下注射至HCG注射日，一般用藥14～18 d后可達到垂體降調節(jié)目的(滿足條件：子宮內膜≤5 mm，血清E2水平<110 pmol/L，LH<5 U/L，雙側卵巢卵泡直徑<5 mm)。在月經周期第2～5天開始給予麗申寶(上海麗珠)促排卵，起始用藥劑量75～112.5 U/d，而后依據B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況調整給藥劑量。對選擇使用GH的PCOS患者，在開始使用麗申寶的同時注射重組生長激素珍怡(上海聯合賽爾生物)4 U/d，直至HCG日。當超聲監(jiān)測50%卵泡平均徑線≥17～18 mm時，當日采集患者靜脈血并肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG，上海麗珠)10 000 U。36 h后，經陰道B超引導下取卵，并收集卵泡液和顆粒細胞。

2.卵母細胞體外培養(yǎng)與授精：取卵獲得的卵丘-卵母細胞復合體于撿卵皿(G-IVF plus，Vitrolife，瑞典)中經37℃ 、 6% CO2、5% O2和 89% N2培養(yǎng)箱體外培養(yǎng)3～4 h后，利用透明質酸酶(Vitrolife，瑞典)脫去卵周顆粒細胞，并對所有的MⅡ卵行ICSI授精。余下的MⅠ和GV卵同等條件下繼續(xù)體外培養(yǎng)16 h，對培養(yǎng)成熟的MⅡ卵行ICSI授精。記錄并比較兩組患者在體外繼續(xù)培養(yǎng)前后MⅡ卵數、MⅠ卵數、GV卵數、總MⅡ卵率、ICSI受精率、卵裂率和優(yōu)胚率及治療周期取消率的差異。

3.激素與核酸檢測：將收集到的血液和卵泡液經2 000 r/min 離心10 min 后取上清液，置于-80℃冰箱保存，等待統(tǒng)一送檢。采用全自動化學發(fā)光法檢測血清和卵泡液中E2、GH及胰島素樣生長因子-I(IGF-I)含量。熒光定量PCR法檢測取卵日收集的卵巢顆粒細胞上IGF-1R mRNA、GHR mRNA和StAR mRNA的基因表達量。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、一般資料比較

兩組患者的年齡、體重指數(BMI)、血清基礎性激素和抗苗勒氏管激素(AMH)水平、中重度卵巢刺激綜合征(OHSS)的發(fā)生率及進行ICSI的病因組成均無顯著性差異(P>0.05)，而使用Gn天數和Gn總劑量存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。因無可用胚胎、子宮內膜差或預防OHSS等原因，兩組取消新鮮移植的患者數分別為22例和23例，使用GH組患者的周期取消率顯著低于未使用GH組患者(P<0.05)(表1)。其余患者經Day3移植2枚優(yōu)質卵裂胚后，使用GH組15例獲得臨床妊娠，而未使用GH組3例獲得臨床妊娠，兩組的臨床妊娠率分別為68.2%和37.5%。

表1 兩組患者一般資料比較[(-±s)，%]

注：與未使用GH組比較，*P<0.05

二、外源GH對PCOS患者卵母細胞發(fā)育成熟的作用

取卵后離體的卵母細胞經體外培養(yǎng)3～4 h后，比較兩組患者的MⅡ卵數、MⅠ卵數、GV卵數和總MⅡ卵率，發(fā)現COH過程中使用GH組患者的MⅡ卵數和總MⅡ卵率均顯著高于未使用GH組患者(P<0.05)，而MⅠ卵數和GV卵數均顯著低于后者(P<0.05)。ICSI授精后觀察兩組患者受精、卵裂和胚胎發(fā)育情況，發(fā)現與未使用GH組相比，使用GH組患者的正常受精率、卵裂率和優(yōu)胚率均顯著增高(P<0.05)。將ICSI授精后余下的未成熟卵經體外繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，不僅每組患者的MⅡ卵數、MⅠ卵數和GV卵數均低于繼續(xù)培養(yǎng)前的對應值，而且其總MⅡ卵率、正常受精率、卵裂率和優(yōu)胚率也均顯著低于后者的對應值(P<0.05)；但繼續(xù)體外培養(yǎng)后各指標在兩組患者間均沒有顯著差異(P>0.05)(表2)。

三、外源GH對PCOS患者血液與卵泡液中GH、E2和IGF-1水平的影響

利用全自動化學發(fā)光法檢測HCG日血清和取卵日卵泡液中E2、GH及IGF-I含量，發(fā)現兩者中的GH和IGF-1含量無顯著性差異(P>0.05)，而血清E2含量顯著低于卵泡液(P<0.05)。使用GH組患者血清和卵泡液中上述各指標值均高于未使用GH組患者，其中兩組間血清與卵泡液GH和IGF-1及卵泡液E2的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表3)。

表2 兩組患者卵母細胞發(fā)育成熟及授精后結局的比較[(-±s)，%]

注：與未使用GH組比較，*P<0.05；與繼續(xù)培養(yǎng)前的同組別相比，#P<0.05

表3 兩組患者血清和卵泡液E2、GH及IGF-I含量的比較(-±s)

注：與未使用GH組比較，*P<0.05；與同組血清中的含量相比，#P<0.05

四、外源GH對PCOS患者卵巢顆粒細胞上GHR mRNA、IGF-1R mRNA和StAR mRNA基因表達的影響

類固醇合成快速調節(jié)蛋白(StAR)在甾體激素合成限速步驟中起關鍵性作用[4]。為了分析外源GH在卵泡發(fā)育、卵母細胞成熟和甾體激素合成過程中的作用方式，本研究進一步檢測了兩組患者卵巢顆粒細胞上GH受體基因GHR mRNA、IGF-1受體基因IGF-1R mRNA和類固醇合成快速調節(jié)蛋白基因StAR mRNA的表達水平，發(fā)現COH過程中使用GH組其取卵日卵巢顆粒細胞上GHR mRNA、IGF-1R mRNA和StAR mRNA的表達較之未使用GH組均顯著增多(P<0.05)(圖1)。

五、卵泡液GH含量與其它指標的相關性分析

結果呈現，卵泡液中GH含量與卵泡液IGF-1和E2水平、MⅡ卵數及顆粒細胞GHR mRNA、IGF-1R mRNA和StAR mRNA相對表達量均顯著正相關(P<0.05)。此外，卵泡液IGF-1與卵泡液E2、MⅡ卵數及顆粒細胞GHR mRNA、IGF-1R mRNA和StAR mRNA相對表達量，以及卵泡液E2與MⅡ卵數和顆粒細胞StAR mRNA呈現顯著正相關關系(P<0.05)(表4)。

與未使用GH組相比，*P<0.05

表4卵泡液GH含量與其它指標的相關性分析

卵泡液GH卵泡液IGF-1卵泡液E2MⅡ卵數顆粒細胞GHR mRNA顆粒細胞IGF-1R mRNA顆粒細胞StAR mRNA卵泡液GH10.715??0.268?0.243?0.710??0.610??0.239?卵泡液IGF-10.715??10.406??0.268?0.870??0.633??0.238?卵泡液E20.268?0.406??10.358??0.1310.1690.443??MⅡ卵數0.243?0.268?0.358??10.1630.0400.230顆粒細胞GHR mRNA0.710??0.870??0.1310.16310.577??0.242?顆粒細胞IGF-1R mRNA0.610??0.633??0.1690.0400.577??10.035顆粒細胞StAR mRNA0.239?0.238?0.443??0.2300.242?0.0351

注：*在0.05水平(雙側)上顯著相關;**在0.01水平(雙側)上顯著相關

討 論

GH是一種蛋白質多肽類激素，主要由垂體前葉分泌，具有促進機體生長發(fā)育和細胞增殖等多種生理功能，能夠在女性生殖系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。GH分泌不足的女性可出現青春期延遲或成年后卵巢對Gn的反應性下降。在卵巢反應不良患者的COH過程中添加外源GH能夠以更低的Gn使用劑量和更短的使用時間促進卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟[5]，增加MⅡ卵數量，并顯著提高受精率[6-7]、優(yōu)胚率[8]、可移植胚胎數[9]和臨床妊娠率[10]。

PCOS患者存在內在性卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟障礙，常導致COH后的卵母細胞成熟率較低。為了探討添加外源GH的COH方案對改善PCOS患者卵母細胞發(fā)育成熟及其胚胎體外發(fā)育潛能的有效性，本研究比較了使用GH組PCOS患者與未使用GH組PCOS患者的卵母細胞離體培養(yǎng)3～4 h后其各自MⅡ卵數、MⅠ卵數、GV卵數、總MⅡ卵率和ICSI受精率及受精后胚胎發(fā)育情況的差異，發(fā)現與未使用GH組患者相比，使用GH組患者的MⅡ卵數、總MⅡ卵率、ICSI正常受精率、卵裂率和優(yōu)胚率均顯著升高(P<0.05)，而MⅠ卵數和GV卵數均顯著降低(P<0.05)。說明使用GH組患者得到的卵母細胞成熟度更高且其受精能力和胚胎發(fā)育潛能更好，提示該COH方案同樣適用于PCOS患者。此外，本研究發(fā)現COH過程中使用外源GH同樣能減少PCOS患者的Gn使用天數和總使用劑量，與劉珍等[11]結果存在差異，可能與研究所選的病例構成不同有關。

GH的作用過程復雜，目前尚不清楚外源GH在COH過程中起作用的具體機制。以往的研究表明，GH能通過受體-配體途徑或IGF-1介導的途徑來促進卵泡發(fā)育、甾體激素合成和卵母細胞成熟[12]。本研究發(fā)現使用外源GH的患者其血清和卵泡液GH、IFG-1和E2含量均增高，其中血清和卵泡液GH和IGF-1及卵泡液E2含量的變化具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且卵泡液GH含量與卵泡液IGF-1和E2含量及MⅡ卵數顯著正相關，證實了外源GH的使用與患者卵泡發(fā)育、甾體激素合成和卵母細胞成熟等功能增強的關聯性。同時，通過檢測卵巢顆粒細胞GH受體GHR和IGF-1受體IGF-1R的表達水平，發(fā)現取卵日使用GH組患者卵巢顆粒細胞GHR mRNA和IGF-1R mRNA的表達水平均顯著高于未使用GH組(P<0.05)，且卵泡液GH和IGF-1含量與顆粒細胞GHR mRNA和IGF-1R mRNA表達水平正相關。說明外源GH的使用提高了PCOS患者卵泡液的GH含量，后者通過上調其受體基因GHR mRNA的表達，增強了配體-受體通路活性，進而促進了機體對IGF-1及其受體的合成與分泌。研究表明，GH和IGF-1含量升高可以獨自或相互協(xié)同提高卵巢對Gn的敏感性，促進卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟[5]；GH上調受體基因的表達能調節(jié)線粒體活性和(或)細胞內鈣穩(wěn)態(tài)，進而提高卵母細胞質量[1，13]，且卵母細胞所處的卵泡液中GH含量越高，形成的胚胎質量越好[14]；而升高的IGF-1還能夠抑制卵泡凋亡[15]，增強卵泡刺激素和芳香化酶活性，從而促進卵泡發(fā)育和甾體激素合成與轉化。

然而，進一步比較ICSI授精后余下的未成熟卵在體外同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)16 h后的卵母細胞成熟度及成熟MⅡ卵ICSI授精和培養(yǎng)結局，發(fā)現此時兩組患者的總MⅡ卵率、ICSI正常受精率、卵裂率和優(yōu)胚率均顯著低于繼續(xù)培養(yǎng)前的對應值(P<0.05)，但兩組間比較，差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。說明體外成熟的卵母細胞其成熟度、受精能力和胚胎發(fā)育潛能均顯著低于體內成熟的卵母細胞，且不受COH過程中是否使用GH的影響。提示外源GH改善卵母細胞成熟度的作用依賴于配體-受體途徑及IGF-1介導的途徑所建立的激素和細胞因子微環(huán)境。

需要指出的是，盡管本研究發(fā)現添加外源GH的COH方案能夠顯著改善PCOS患者卵母細胞成熟度及其胚胎體外發(fā)育潛能，但鑒于PCOS患者的臨床復雜性，是否對每位PCOS患者或者對哪些特定患者建議采用該種COH方案值得進一步研究。