張光輝，邵小燕，嚴(yán)小敏

（重慶國聯(lián)干細(xì)胞技術(shù)有限公司，重慶 401325）

近年來，隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，對于腫瘤的治療，細(xì)胞免疫治療已經(jīng)成為繼手術(shù)、放療、化療的第四種模式。常用的免疫細(xì)胞主要有細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cells, CIK）、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cells, NK）、樹突狀細(xì)胞（dendritic cells, DC）等[1]。CIK細(xì)胞是主要表達(dá)CD3+CD56+的一群淋巴細(xì)胞，而NK細(xì)胞主要表達(dá)CD3-CD56+。CIK、NK等細(xì)胞治療是通過提取患者外周血的單個核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），在體外誘導(dǎo)擴(kuò)增而制備所得[2]。大量的臨床研究表明，CIK、NK具有提高腫瘤臨床治愈率、減少腫瘤復(fù)發(fā)、改善生活質(zhì)量、延長生存期等作用[3]。目前，體外誘導(dǎo)CIK和NK的技術(shù)都比較成熟，可以獲得滿足臨床使用的細(xì)胞。但是，臨床中所使用的細(xì)胞多為CIK或NK單獨(dú)使用，聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行治療的較少，且聯(lián)合應(yīng)用對腫瘤細(xì)胞的殺傷功能缺乏報道。本研究通過采集腫瘤患者的外周血體外誘導(dǎo)擴(kuò)增得到CIK和NK，對兩種細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用對腫瘤細(xì)胞的殺傷功能進(jìn)行檢測。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至7月在重慶新橋醫(yī)院所收治的10例腫瘤患者（均簽署知情同意書），年齡43～68歲，平均年齡為（53.6±3.2）歲，其中男性6例、女性4例。其中肺癌3例，乳腺癌2例，胃癌2例，宮頸癌1例，肝癌1例，食管癌1例。所有患者在采集外周血15天內(nèi)未接受放化療。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

重組人白介素2（interleukin-2，IL-2，100萬IU/瓶），購自北京四環(huán)生物制藥有限公司；重組人白介素12（50 μg/支）、重組人白介素15（50 μg/支）、抗人CD3單抗（500 μg/支）、重組人γ-干擾素（100 μg/支），均購自北京同立海源生物科技有限公司；培養(yǎng)基（GT-T551，1 L/瓶），購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；淋巴細(xì)胞分離液（LTS1077，200 mL/瓶），購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；CD3-FITC（100tests/支）和CD56-APC（100tests/支），購自Biolegend公司；CCK-8，購自碧云天生物技術(shù)研究所；人慢性髓系白血病細(xì)胞K562細(xì)胞，購自中科院上海細(xì)胞生物研究所；T75、T225細(xì)胞培養(yǎng)瓶、移液管、離心管等無菌耗材，購自康寧公司；培養(yǎng)箱為賽默飛3111；離心機(jī)為艾本德5810/5810R；細(xì)胞計數(shù)儀為Nexcelom AUTOT4；流式細(xì)胞儀為BD Accuri C6；分析軟件為BD Accuri CFLOW。

1.3 CIK、NK的細(xì)胞制備[4]

清晨飽腹后抽取患者外周靜脈血50 mL于肝素鈉采血管中，離心獲取血清及全血細(xì)胞。收集血清經(jīng)56 ℃水浴滅活30 min后，離心獲取上清即自體血漿備用。全血細(xì)胞經(jīng)生理鹽水1∶1稀釋后使用淋巴細(xì)胞分離液離心獲取PMBC。PMBC重懸于含有10%自體血漿的培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×106個/mL。CIK細(xì)胞培養(yǎng)：添加抗人CD3單抗、γ-干擾素、IL-2。NK細(xì)胞培養(yǎng)：添加IL-2、白細(xì)胞介素-12、白細(xì)胞介素-15。細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)期間抽樣計數(shù)，根據(jù)細(xì)胞生長計數(shù)情況進(jìn)行補(bǔ)液擴(kuò)瓶，控制細(xì)胞密度為1.0×106個/mL。

1.4 細(xì)胞純度檢測

分別取第14天的細(xì)胞懸液，離心重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×107個/mL，每管100 μL。CIK、NK細(xì)胞表型檢測：分別加入抗體CD3-FITC、CD56-APC各2 μL，孵育20 min洗滌后行流式細(xì)胞表型檢測，CIK檢測CD3+CD56+細(xì)胞的比例，NK檢測CD3-CD56+細(xì)胞的比例。

1.5 細(xì)胞殺傷活性檢測

使用CCK-8檢測試劑盒進(jìn)行細(xì)胞殺傷活性的檢測。取培養(yǎng)第14天的細(xì)胞懸液，離心后調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106個/mL，作為效應(yīng)細(xì)胞。取對數(shù)生長期的人慢性髓系白血病細(xì)胞K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×104個/mL，作為靶細(xì)胞。按照效靶比分別為5∶1、10∶1、20∶1的比例進(jìn)行細(xì)胞混合，培養(yǎng)于96孔板內(nèi)，每孔總體積2 mL。同時，設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞孔、靶細(xì)胞孔、空白對照孔，實(shí)驗(yàn)組為CIK組、NK組、CIK/NK聯(lián)合組（1∶1）每組設(shè)3個復(fù)孔。置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8試劑20 μL，置入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h后于450 nm測定吸光度（A）值。按如下公式計算細(xì)胞殺傷活性：殺傷率=[1-（實(shí)驗(yàn)孔A值-效應(yīng)細(xì)胞孔A值）∕靶細(xì)胞孔A值]×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料符合正態(tài)分布用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)情況

培養(yǎng)的CIK、NK細(xì)胞第14天時，CIK細(xì)胞數(shù)量達(dá)到（5.3±1.2）×109（F=13.325，P=0.018，n=10），NK細(xì)胞數(shù)量達(dá)到（5.3±1.2）×109（F=15.428，P=0.016，n=10）。CIK細(xì)胞的純度為（50.7±1.2）%（F=15.354，P=0.017，n=10），NK細(xì)胞的純度為（46.3±4.7）%（F=16.337，P=0.018，n=10）。由細(xì)胞的數(shù)量和純度來看，培養(yǎng)所得的CIK、NK細(xì)胞可以滿足臨床使用。

2.2 細(xì)胞殺傷活性檢測

以培養(yǎng)第14天的細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，K562細(xì)胞為靶細(xì)胞，在效靶比5∶1、10∶1、20∶1下的殺傷情況為：CIK細(xì)胞組的殺傷率分別為（31.2±1.5）%、（42.7±2.1）%、（61.3±2.2）%，不同組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.724，P=0.016）。NK細(xì)胞組的殺傷率分別為（35.4±1.7）%、（46.2±2.3）%、（63.5±2.1）%，不同組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=13.521，P=0.015）。CIK/NK 1∶1聯(lián)合組的殺傷率分別為（48.1±1.9）%、（61.3±2.5）%、（81.2±2.6）%，不同組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=16.432，P=0.018）。由此可見，CIK/NK聯(lián)合應(yīng)用對腫瘤細(xì)胞的殺傷率高于單獨(dú)使用CIK和NK細(xì)胞。

3 討 論

免疫細(xì)胞是人體發(fā)揮免疫功能的重要細(xì)胞，其通過血液、淋巴循環(huán)分布在免疫器官和組織中。CIK和NK細(xì)胞是進(jìn)行腫瘤免疫治療的兩個重要部分。CIK是一群具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性及NK細(xì)胞的非主要組織相容性復(fù)合物（Major Histocompatibility Complex，MHC）限制性細(xì)胞，CD3+CD56+細(xì)胞是其主要的效應(yīng)細(xì)胞。CIK細(xì)胞主要是以MHC限制性的方式殺傷靶細(xì)胞，DC細(xì)胞通過MHC限制性的方式抗原呈遞給CIK細(xì)胞，以激活CIK細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，清除殘存的腫瘤細(xì)胞而發(fā)揮更加強(qiáng)大的細(xì)胞毒性作用[5]。NK細(xì)胞是一群表達(dá)CD3-CD56+的淋巴細(xì)胞，NK細(xì)胞對腫瘤和病毒的識別無MHC限制性，不依賴于抗體，無需致敏就可以發(fā)揮殺傷腫瘤和病毒的功能[6]。NK細(xì)胞也是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的第一道防線。NK細(xì)胞還可分泌多種細(xì)胞因子，如穿孔素、細(xì)胞毒因子、TNF、IFN-γ、IL-2等來發(fā)揮免疫監(jiān)視功能[7]。CIK細(xì)胞能夠特異性的殺傷腫瘤細(xì)胞，但無法識別不表達(dá)MHC-I類分子的腫瘤細(xì)胞，而NK細(xì)胞能識別不表達(dá)MHC-I類分子的腫瘤細(xì)胞，并能殺傷腫瘤細(xì)胞，因此，兩者的共同回輸可對大部分腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效殺傷[8]。

本研究采集了10例腫瘤患者的外周血，通過體外誘導(dǎo)擴(kuò)增，獲取CIK、NK細(xì)胞，并對其體外殺傷活性進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，體外培養(yǎng)可以獲得滿足臨床治療所需數(shù)量和純度的細(xì)胞。對K562腫瘤細(xì)胞的殺傷效果來看，CIK、NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用高于單獨(dú)使用，可以證實(shí)兩者的共同作用不僅僅是兩種細(xì)胞殺傷毒性的簡單疊加，而是因?yàn)槎呖上嗷ゴ龠M(jìn)各自的活化與免疫反應(yīng)，顯著提高機(jī)體的免疫反應(yīng)。

本研究為CIK、NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤免疫治療提供了體外實(shí)驗(yàn)依據(jù)，因而提示我們可以在臨床上聯(lián)合應(yīng)用CIK和NK細(xì)胞進(jìn)行腫瘤治療，增強(qiáng)抗腫瘤活性，提高臨床緩解率，改善患者生活質(zhì)量。