易琳

（西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充 637000）

人類的身體健康、生命安全長期受到微生物污染的威脅，營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)法是國際上針對微生物檢測的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法，然而該方法要求在37 ℃下持續(xù)培養(yǎng)48 h，過于繁瑣的操作無法實(shí)現(xiàn)快速檢測?，F(xiàn)下，國內(nèi)也加大了對核酸法、電阻抗測量、免疫學(xué)方法、微菌落技術(shù)等各類微生物快速檢測技術(shù)展開了研究、應(yīng)用。ATP生物發(fā)光法因快速、簡便且具有較高靈敏度的緣故，可用于實(shí)時(shí)監(jiān)控微生物污染，與食品行業(yè)需求相符合，故而有關(guān)該技術(shù)的研究與應(yīng)用十分廣泛。

1 食品檢驗(yàn)中現(xiàn)代生物技術(shù)應(yīng)用的重要性

品質(zhì)較高的食品安全檢驗(yàn)?zāi)転槭称诽峁┮欢ǖ陌踩员Ｕ?。我國近年來逐漸加大了有關(guān)食品安全問題的重視程度，在現(xiàn)代生物理論的運(yùn)用下，促使現(xiàn)代生物技術(shù)獲得了更為廣泛的運(yùn)用領(lǐng)域[1]。同時(shí)，近年來生物技術(shù)的快速發(fā)展，使其得以在實(shí)現(xiàn)精確測試檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，也具備了安全、環(huán)保等特點(diǎn)，十分適用于食品安全檢驗(yàn)。傳統(tǒng)生物及食品檢驗(yàn)技術(shù)難以為食品提供可靠的安全性保障，這也進(jìn)一步凸顯了現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展前景。鑒于此，本文深入探究了ATP生物發(fā)光法在微生物檢測中的運(yùn)用。

2 ATP生物發(fā)光技術(shù)檢測微生物的原理及一般步驟

ATP生物發(fā)光技術(shù)是在Mg2+和熒光素酶E的作用下，ATP與熒光素LH2產(chǎn)生腺苷?；换罨?，而熒光素在被活化后結(jié)合熒光素酶會(huì)有熒光素—AMP復(fù)合體形成，且會(huì)有焦磷酸（PPi）產(chǎn)生。當(dāng)分子氧將復(fù)合體氧化后，會(huì)有激發(fā)態(tài)復(fù)合物P*-AMP形成，并有CO2產(chǎn)生。而該復(fù)合物由激發(fā)態(tài)朝著基態(tài)轉(zhuǎn)化期間會(huì)有光射出，最終會(huì)有氧化沖熒光素P和AMP形成。具體反應(yīng)過程如下：

就ATP生物發(fā)光技術(shù)而言，其檢測步驟通常為：首先對ATP生物發(fā)光值及樣品微生物含量標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行繪制，隨后在取樣、ATP提取、酶反應(yīng)試劑添加、樣品微生物ATP發(fā)光值測定完成之后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線為根據(jù)對樣品中微生物實(shí)際數(shù)值進(jìn)行測定。

3 ATP生物發(fā)光法的優(yōu)缺點(diǎn)

ATP生物發(fā)光法主要包含簡便、快速及較好重現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)。但是，因其對樣品提出了至少1 000個(gè)/mL細(xì)菌濃度的要求，故而無法將衛(wèi)生學(xué)提出的有關(guān)靈敏度的要求有效滿足。同時(shí)也有ATP生物發(fā)光法無法對微生物及非微生物的ATP進(jìn)行區(qū)分等缺點(diǎn)[2]。ATP生物發(fā)光法優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用范圍見表1、表2。

表1 ATP生物發(fā)光法優(yōu)缺點(diǎn)

表2 ATP生物發(fā)光法應(yīng)用范圍

4 ATP生物發(fā)光技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用——以酸奶Fe3O4檢測為例

4.1 試驗(yàn)方法

化學(xué)發(fā)光檢測：取出1.0μ mol的氨基改性Fe3O4納米粒子，采用吡啶緩沖液反復(fù)清洗后，添加200 μL戊二醛溶液并置于室溫環(huán)境下持續(xù)3h振蕩。加入ATP適體10 pmol，置于室溫環(huán)境下持續(xù)振蕩1 h。采用WB清洗液反復(fù)清洗后，在其內(nèi)加入2% BSA溶液200μL，置于室溫環(huán)境下持續(xù)振蕩1 h。再次采用WB清洗液反復(fù)清洗后，將Fe3O4納米粒子移入100 μL ATP中（濃度為2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、6 μmol/L、10 μmol/L、12 μmol/L），置于室溫環(huán)境下持續(xù)振蕩1 h[3]。再次采用WB清洗液反復(fù)清洗后磁性分離，借助超純水將Fe3O4納米粒子朝著一端開口的圓柱形玻璃瓶內(nèi)轉(zhuǎn)移，并置于BPCL微弱發(fā)光儀中，加入90 μL熒光素酶緩沖液，對其熒光發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行測量，最終信號(hào)值以最高信號(hào)值出現(xiàn)后10 s的積分值為主。

借助化學(xué)發(fā)光法檢測ATP特異性并開展干擾性實(shí)驗(yàn)：取出1.0 μmol的氨基改性Fe3O4納米粒子，采用吡啶緩沖液反復(fù)清洗后，添加200 μL戊二醛溶液并置于室溫環(huán)境下持續(xù)3h振蕩。加入10 pmol ATP適體在室溫環(huán)境下持續(xù)振蕩1h。采用WB清洗液反復(fù)清洗后，在其內(nèi)加入200μL 2% BSA溶液，置于室溫環(huán)境下持續(xù)振蕩1h。借助WB清洗液再次清洗后，在CTP溶液（100μL）、UTP溶液（100μL）、GTP溶液（100μL）、ATP和CTP混合液、ATP和GTP混合液、空白AA緩沖液中加入ATP溶液（10μmol/L），置于室溫環(huán)節(jié)下持續(xù)1h振蕩[4]。采用WB清洗液反復(fù)清洗后磁性分離。借助超純水將Fe3O4納米粒子朝著一端開口的圓柱形玻璃瓶內(nèi)轉(zhuǎn)移，并置于BPCL微弱發(fā)光儀中，加入90μL熒光素酶緩沖液，對其熒光強(qiáng)度進(jìn)行測量。

4.2 結(jié)果

依據(jù)上述檢測結(jié)果完成曲線圖的繪制。根據(jù)圖1能發(fā)現(xiàn)，R2=0.996 3時(shí)，具有良好的線性范圍，在ATP定量檢測中十分適用。在CTP、GTP、UTP溶液中，表現(xiàn)出較低熒光強(qiáng)度；而在ATP、CTP、GTP、UTP混合溶液中，熒光強(qiáng)度所受到的影響并不大，實(shí)驗(yàn)具有較高可行性。

圖1 化學(xué)發(fā)光檢測ATP工作曲線

在測定酸奶中ATP時(shí)，將乳酸菌中ATP提取后，以Fe3O4納米粒子作為實(shí)驗(yàn)對象，依據(jù)化學(xué)發(fā)光法對其發(fā)光值檢測，依據(jù)特性完成ATP捕獲[5]。依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得知，隨著乳酸菌含量的增加，化學(xué)發(fā)光值及ATP提取量也在上升，實(shí)驗(yàn)存在較為突出的重復(fù)性。通過圖2了解到，每mL酸奶乳酸菌中含有3.98×10-8mol ATP量。故而，針對本試驗(yàn)中的Fe3O4納米粒子而言，可在視頻分析檢測領(lǐng)域中作為載體使用。

圖2 不同溶液中ATP發(fā)光值的測定

5 結(jié)論

ATP發(fā)生發(fā)光法相對于其他微生物快速檢測方法而言，因簡單、快速便捷及較高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)的緣故，優(yōu)勢十分突出，被廣泛運(yùn)用于食品加工行業(yè)之中[6]。然而，由于外界因素極易對該方法造成干擾的緣故，對于微生物種類無法實(shí)現(xiàn)定性鑒別，在直接檢測個(gè)別樣品時(shí)也無法將要求的靈敏度實(shí)現(xiàn)[7]。故而，ATP提取劑的合理選擇、外界因素干擾的降低、微生物特異性識(shí)別的增強(qiáng)及檢測靈敏度的提高成為了該方法進(jìn)一步改善及深入研究的重要方向。

ATP生物發(fā)光法具備103CFU/mL的檢測限，然而大部分致病菌卻呈現(xiàn)出10 CFU/mL的致病濃度。因免疫磁分離技術(shù)（IMS）可將濃縮、選擇性分離等作用發(fā)揮在樣品中，故而將ATP生物發(fā)光法與IMS技術(shù)結(jié)合后對細(xì)菌進(jìn)行檢測，不但可將外界因素干擾降低，同時(shí)也能對微生物進(jìn)行特異性識(shí)別，可實(shí)現(xiàn)檢測靈敏度的有效提升[8]。同時(shí)，針對熒光毛細(xì)分析法而言，在發(fā)光檢測儀中引入毛細(xì)管可實(shí)現(xiàn)小型化。在不斷發(fā)展的科技技術(shù)下，ATP生物發(fā)光法必然能夠更為成熟、完善，其應(yīng)用領(lǐng)域、范圍也必然會(huì)不斷擴(kuò)大。