陳明峰, 林桂芳, 蔣曉燕, 王 瑞, 許 瑾, 劉文誠, Khadija BATOOL, 關(guān) 雄, 張靈玲

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

茶小綠葉蟬(Empoascaflavescens)是茶樹上三大害蟲之一[1].該蟲為同翅目(Homoprtera)昆蟲，有蟲體小、繁殖能力強、疊代情況嚴(yán)重等特點.該蟲有刺吸式口器，以茶樹嫩芽葉為食，會造成葉脈、葉片、芽葉等出現(xiàn)不同程度的變紅、萎縮甚至掉葉等現(xiàn)象，直接影響茶葉的產(chǎn)量和茶產(chǎn)品的品質(zhì).我國江、浙、皖、贛、鄂、湘、蜀、閩、粵、桂等省、區(qū)茶葉主產(chǎn)區(qū)都受到了茶小綠葉蟬不同程度的危害[2].

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)因為對環(huán)境友好、殺蟲譜廣且對人畜無害而成為當(dāng)今世界上研究最深入、應(yīng)用最廣泛的一類微生物殺蟲劑[3].Bt Cry蛋白是一種成孔細(xì)胞毒素，其殺蟲活性主要取決于毒蛋白活性片段的酶解及其與特異受體結(jié)合后在中腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜蛋白上形成離子通道的能力.目前，已經(jīng)基本明確的Bt受體有APN[4]、Cadherin_[5]、ALP[6]、肌動蛋白[7]以及glycolipids[8]等.Bt的殺蟲機理決定了Bt殺蟲蛋白對昆蟲中腸受體具有選擇性[9]；同時，毒素受體缺乏或突變會使昆蟲與殺蟲蛋白結(jié)合能力下降或喪失，或者導(dǎo)致昆蟲對Bt產(chǎn)生耐藥性.研究表明，Bt對茶小綠葉蟬無明顯殺蟲效果，有關(guān)其機制尚不明確[10].課題組前期已對該蟲進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，并開展了茶小綠葉蟬腸液對部分Cry毒素的酶解分析，發(fā)現(xiàn)雖然該蟲腸液對Cry1Ac和Cry11A酶解程度不夠徹底，但仍有相當(dāng)比例的毒素可被酶解成活性片段[11].因此，本研究從Bt殺蟲的另一個關(guān)鍵步驟——受體與毒素活性片段的結(jié)合著手，依據(jù)實驗室前期獲得的茶小綠葉蟬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對該蟲的Bt潛在受體基因進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步明確Bt對茶小綠葉蟬的作用機制提供一定理論依據(jù)，也為開發(fā)新型生物農(nóng)藥奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

本研究所用茶小綠葉蟬采集于福建省福安市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所2號山平地品種為金觀音的茶樹.

1.2 試劑

E.Z.N.A. HP Total RNA Kit由OMEGA提供；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO公司；250 bp DNA Ladder Marker購自TaKaRa公司；熒光定量試劑盒購于Roche Company；溴化乙錠染色液購于TaKaRa公司.TAE(50×)配制：稱取242 g Tris-base、37.2 g Na2EDTA·2H2O，先用適量的滅菌水溶解，定容至1 L，再用57.1 mL乙酸攪拌至完全溶解.

1.3 方法

1.3.1 茶小綠葉蟬轉(zhuǎn)錄組Bt潛在受體基因的篩選 根據(jù)課題組前期對茶小綠葉蟬轉(zhuǎn)錄組RNA-seq得到的Unigene注釋了transcripts(NCBI BioProject ID: SRP075995)[12].利用這些數(shù)據(jù)并依據(jù)關(guān)鍵字(ALP、APN、Cadherin)和GPI瞄定位點信息,從de novo組裝注釋的轉(zhuǎn)錄本找出注釋為ALP、APN、Cadherin的功能基因；利用RNA-seq得到差異性表達(dá)數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)量，即FPKM值(每百萬Reads中來自比對到某一基因每千堿基長度的Reads數(shù)目)，直接比較不同樣品間3類潛在受體基因的表達(dá)差異.以FPKM值為指標(biāo)，將FDR(false discovery rate)<0.01作為閾值，且差異倍數(shù)FC(fold change)≥2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)(其中FC表示2個樣品表達(dá)量的比值)，篩選出可表達(dá)的3類潛在受體基因，并比較其在茶小綠葉蟬中腸和腸外組織中的表達(dá)量，從而篩選出茶小綠葉蟬Bt Cry潛在受體靶基因.

1.3.2 Heatmap作圖分析潛在受體基因 利用在de novo組裝注釋的轉(zhuǎn)錄本找到注釋為ALP、APN、Cadherin功能的基因，再根據(jù)差異性分析中計算的表達(dá)量進(jìn)行FPKM值分析，找出候選功能基因在茶小綠葉蟬中腸和腸外組織的表達(dá)量.用R語言Heatmap軟件作圖，通過熱點分布情況對茶小綠葉蟬腸道及腸外組織ALP、APN、Cadherin基因的相對表達(dá)量進(jìn)行可視化分析，以找出在中腸中表達(dá)量高且與腸外組織表達(dá)量差異顯著的潛在受體基因.

1.3.3 RT-qPCR驗證 參照OMEGA總RNA提取試劑盒操作說明提取茶小綠葉蟬總RNA，并從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出8個ALP、7個APN和8個Cadherin差異表達(dá)候選基因，設(shè)計并委托鉑尚生物公司合成引物，以茶小綠葉蟬actin基因(GenBank登錄號KJ942579.1)為內(nèi)參基因[13].利用TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后利用熒光定量試劑盒在ABI7500實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)上進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)[11].

每個樣品的實時熒光定量PCR運行完成后進(jìn)行溶解曲線分析，以檢查PCR反應(yīng)的特異性.具體操作步驟：根據(jù)RT-qPCR得到的數(shù)據(jù)，利用溶解曲線分析計算2個組織中所獲得的相對表達(dá)量數(shù)值，相對表達(dá)量計算方法為蟲尸表達(dá)量/腸外組織表達(dá)量；同時，利用Excel做出RT-qPCR得到的各基因的相對表達(dá)量和RNA-seq得到的FPKM值這2組數(shù)據(jù)的散點圖.從表達(dá)相關(guān)性系數(shù)R2驗證RNA-seq的準(zhǔn)確性，R2值越接近于1表示2種方法計算的表達(dá)量越相似，說明RNA-seq的結(jié)果就越可靠.

1.3.4 受體蛋白氨基酸序列同源性分析 利用關(guān)鍵字(ALP、APN、Cadherin)搜索在茶小綠葉蟬de novo組裝注釋的轉(zhuǎn)錄本，尋找腸內(nèi)外表達(dá)差異顯著的ALP、APN、Cadherin 3類23個潛在受體蛋白，在轉(zhuǎn)錄本中找到各自對應(yīng)的氨基酸序列.借助Mega(Version 7.0)軟件構(gòu)建NJ進(jìn)化樹，對ALP、APN、Cadherin 3類潛在受體表達(dá)量差異顯著的基因序列進(jìn)行同源性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 茶小綠葉蟬潛在受體篩選

由于目前未獲得茶小綠葉蟬的基因組測序信息，以NCBI非冗余(non-redundant,nr)數(shù)據(jù)庫和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫作為參考，根據(jù)鱗翅目、雙翅目、半翅目等昆蟲受體信息，選擇APN、ALP、Cadherin為茶小綠葉蟬Cry蛋白候選潛在受體類型.通過BLAST進(jìn)行transcripts的注釋，結(jié)果獲得了52 182個組裝的Unigene.利用關(guān)鍵字篩選轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中Bt在茶小綠葉蟬中腸和腸外組織中差異表達(dá)的潛在受體基因，發(fā)現(xiàn)共有3 327個，其中1 191個上調(diào)表達(dá)，2 136個下調(diào)表達(dá).

按照FC≥2、FDR<0.01的原則，篩選獲得123個顯著差異表達(dá)基因，包括13個APN、25個ALP、85個Cadherin.其中，在中腸中表達(dá)量高且與腸外表達(dá)量差異顯著的APN、ALP、Cadherin基因有23個，依序分別重命名(表1).

表1 篩選所得的3類受體表達(dá)量差異顯著的基因及其重命名Table 1 Genes screened with significantly different expression levels in 3 types of receptors and their renamings

2.2 3類受體基因表達(dá)量差異的可視化分析

通過Heatmap圖可以看到，茶小綠葉蟬腸內(nèi)外組織大多數(shù)ALP、APN、Cadherin基因的相對表達(dá)量都有明顯的差異，只有少量基因的表達(dá)量比較接近.其中，腸外組織中也存在部分表達(dá)量相對較高的候選基因，包括ALP 3、ALP 4、ALP 6、ALP 7、ALP 8、APN 7、APN 6、Cadherin6、Cadherin8；在中腸中表達(dá)量高的基因有ALP 2、ALP 5、ALP 6、ALP 7、ALP 8、APN 7，其中表達(dá)量最高的為APN 7，ALP 8次之(圖1).

圖中顏色深藍(lán)、淡藍(lán)、黃色、紅色(0～8)代表基因表達(dá)量逐漸升高的趨勢.圖1 3類潛在受體基因在腸外組織和中腸中差異表達(dá)的Heatmap圖Fig.1 Heatmap plots for differential expression of 3 potential receptor genes in intestinal tract and midgut

2.3 RT-PCR分析

將小綠葉蟬RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作模板，以actin基因為內(nèi)參基因，挑選其中19個在中腸中表達(dá)量高且與腸外組織差異表達(dá)的ALP、APN、Cadherin基因進(jìn)行RT-qPCR驗證，發(fā)現(xiàn)表達(dá)相關(guān)性系數(shù)R2值達(dá)到0.951，接近于1(圖2).可見，RT-qPCR所計算的表達(dá)量數(shù)值與RNA-seq基本一致，說明RNA-seq表達(dá)量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠.

x軸和y軸分別代表RNA-seq和RT-qPCR所計算的基因相對表達(dá)量.圖2 RNA-seq表達(dá)量驗證Fig.2 Verification of RNA-seq expression data

2.4 3類潛在受體基因同源性分析

圖3 Cadherin受體基因同源性比對進(jìn)化樹Fig.3 Homology alignment of Cadherin receptor genes

通過Mega(Version 7.0)軟件構(gòu)建8個Cadherin潛在受體基因的NJ進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)Cadherin基因可分為2個亞支，Cadherin2、Cadherin6、Cadherin1、Cadherin3、Cadherin5為分支Ⅰ，Cadherin7、Cadherin4、Cadherin8為分支Ⅱ.Cadherin8相對于其他成員較為古老，Cadherin2和Cadherin6可能是一對較新的基因(圖3).

利用同種方法構(gòu)建ALP和APN受體基因的NJ進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn),ALP受體基因分別位于3個亞支上，其中ALP 1、ALP 5、ALP 7為分支Ⅰ，ALP 2、ALP 3、ALP 6為分支Ⅱ，ALP 4、ALP 8為分支Ⅲ.ALP 1與ALP 7基因間遺傳距離較近.而7個APN基因分別位于2個亞支上，APN 3、APN 5、APN 6、APN 7為分支Ⅰ，APN 1、APN 2、APN 4為分支Ⅱ.

3 討論

APN、ALP和Cadherin是當(dāng)前多種昆蟲已明確的Cry受體類型，在毒素發(fā)揮殺蟲活性的過程中起重要作用[14].蚜蟲等半翅目昆蟲腸道也存在與Bt靶標(biāo)昆蟲類似的ALP、APN等受體，但可能因為其與鱗翅目、雙翅目等昆蟲的基因同源性較低，導(dǎo)致Cry對其殺蟲活性也相對較低[14-15].本研究在前期已獲得的茶小綠葉蟬腸內(nèi)外組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析這3類潛在受體的基因信息，通過de novo組裝注釋的轉(zhuǎn)錄本transcripts獲得了52 182個組裝的Unigene[12]，其中有3 327個基因存在差異性表達(dá).同時，從這些差異性表達(dá)基因中篩選獲得有特異GPI瞄定位點信息的123個顯著差異表達(dá)的ALP、APN、Cadherin 3類受體基因，包括13個APN、25個ALP、85個Cadherin，其中在中腸中表達(dá)量高且中腸內(nèi)外表達(dá)量差異顯著的基因有23個，包括7個APN、8個ALP和8個Cadherin.提取茶小綠葉蟬中腸和腸外組織的RNA，通過RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)這23個候選基因表達(dá)情況與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析一致.

為了解茶小綠葉蟬的潛在受體表達(dá)量差異情況，選擇轉(zhuǎn)錄組信息中表達(dá)量高且腸內(nèi)外表達(dá)差異顯著的23個候選基因為靶標(biāo)，通過相應(yīng)的FPKM值得到的相對表達(dá)量進(jìn)行Heatmap作圖分析，發(fā)現(xiàn)潛在受體基因表達(dá)量存在明顯差異，其中ALP基因的表達(dá)量總體高于APN和Cadherin.而在中腸中表達(dá)量高的基因有ALP 2、ALP 5、ALP 6、ALP 7、ALP 8、APN 7，其中APN 7最高，ALP 8次之.綜合RNA-seq、RT-PCR及進(jìn)化樹分析可以看出，Cadherin6和Cadherin8表達(dá)水平高于其他6個Cadherin類型的受體蛋白，且存在一定的組織特異性，可推測Cadherin6和Cadherin8可能為Bt Cry毒素的潛在受體.在ALP基因中，ALP 1與ALP 7基因間遺傳距離較近，但表達(dá)量存在差異，ALP 1的表達(dá)水平明顯低于ALP 7.可見，ALP 1與ALP 7可能存在功能冗余.而在APN基因的表達(dá)量比較中發(fā)現(xiàn)，APN 7在茶小綠葉蟬中腸中的表達(dá)量高于其他潛在受體，且中腸內(nèi)表達(dá)量相對于腸外組織呈指數(shù)型增長.因此，APN 7可能為Bt Cry毒素的潛在受體.

綜上所述，茶小綠葉蟬存在與鱗翅目、雙翅目等Bt靶標(biāo)昆蟲類似的潛在受體，但可能因為自身存在特異性，與其他昆蟲同類型受體的同源性相對較低.這些潛在受體與常規(guī)受體的差異性是否會影響與毒素結(jié)合進(jìn)而降低Cry毒素的殺蟲效果還需進(jìn)一步深入探討.