曹 興, 易 瑾, 隋娟娟, 吳 澤, 何俊娜, 于守超, 趙 燕, 義鳴放

(1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院花卉發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控北京市重點實驗室，北京 100193；3.阜陽師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037；4.北京師范大學(xué)附屬中學(xué)平谷第一分校，北京 101204)

百合(Liliumspp.)為百合科百合屬球根花卉，具有重要的觀賞、食藥用價值.百合屬的大多數(shù)種及品種性喜冷涼、濕潤氣候，耐熱性較差.目前，國內(nèi)主栽的百合品種生育的適溫為16～24 ℃，30 ℃以上時，生育受到嚴重抑制[1].然而我國大部分地區(qū)夏季炎熱，高溫造成百合生長停滯、植株矮小、少花盲花、莖桿軟、病蟲害嚴重等現(xiàn)象，嚴重影響切花的產(chǎn)量和質(zhì)量，并造成種球退化，制約著我國百合商品化周年生產(chǎn)[2].所以，提高百合耐熱性是解決這一問題的關(guān)鍵.

高溫脅迫下，植物體內(nèi)迅速合成熱激蛋白(heat shock protein, Hsp)，Hsp的大量積累，可作為分子伴侶協(xié)助其他相關(guān)蛋白的重新折疊、穩(wěn)定、運輸和降解，維護細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使細胞產(chǎn)生對高溫的耐受力，從而提高植物的耐熱性.熱激蛋白的表達受熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor, Hsf)的調(diào)控.熱脅迫下，Hsf特異結(jié)合在Hsp基因的熱激元件(heat shock element, HSE)上，并募集其他轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，導(dǎo)致Hsp基因的轉(zhuǎn)錄和Hsp的積累[3].根據(jù)寡聚域(oligomerization domian, OD)結(jié)構(gòu)的不同，Hsf可分為HsfA、HsfB 和HsfC三類，A類Hsf含有激活模序(aromatic, large hydrophobic and acidic amino residues, AHA)具有轉(zhuǎn)錄激活活性，而B類和C類則缺少AHA[4].目前，研究較多、功能較為明確的是A類Hsf[5-7]，C類Hsf的研究較少.在前期研究中，從百合中分離得到了5個A類Hsf基因LlHsfA1[8]、LlHsfA2a[9]、LlHsfA2b[10]、LlHsfA3a和LlHsfA3b[11]，研究表明它們參與了百合的熱激反應(yīng)(heat shock response, HSR).

在百合野生種中，麝香百合(LiliumlongiflorumThunb)的耐熱性較強，它們的雜交品種也具有較強的耐熱性.本研究從麝香百合雜種系‘白天堂’中鑒定了C類熱激轉(zhuǎn)錄因子基因LlHsfC1，研究它與百合耐熱性的關(guān)系，進一步豐富百合Hsf參與的熱信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò).通過解析耐熱百合品種的高溫逆境響應(yīng)機制，鑒定調(diào)控耐熱性的關(guān)鍵基因，對于采用分子育種手段來提高現(xiàn)有主栽百合品種的耐熱性具有重要的理論和實踐意義.

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為麝香百合(Liliumlongiflorum)品種‘白天堂’(‘White Heaven’)組培苗，保存于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉發(fā)育與品質(zhì)調(diào)控北京市重點實驗室.亞細胞定位使用的材料為紫皮洋蔥(Alliumcepa)，購買于超市.

表1 PCR引物1)Table 1 Primers applied in PCR

1)下劃線表示酶切位點.

試驗所用的RNA提取試劑盒、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA片段回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T載體、T4連接酶、SalⅠ、SpeⅠ、SmaⅠ等購自TaKaRa公司；熒光定量試劑盒SYBR FAST qPCR Universal Kit購自KAPA公司；卡那霉素(Kan)、氨芐青霉素(Amp)購自Sigma公司；其他常規(guī)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純；擴增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)；DNA測序由北京六合華大基因科技有限公司完成.

1.2 百合HsfC1基因的鑒定及生物信息學(xué)分析

根據(jù)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)GenBank數(shù)據(jù)庫中的百合LlHsf1(AEU17861)的氨基酸序列，進行BLAST比對，選擇相似度較高的同源蛋白，用DNAMAN 5軟件進行多重比對分析.用EXPASY (https://www.expasy.org/tools/)中的ProtParam、SMART、PSORT、NetPhos等在線工具對蛋白質(zhì)進行生物信息學(xué)分析；用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.

1.3 LlHsfC1蛋白亞細胞定位分析

利用DNAMAN 5分析LlHsfC1的ORF序列的酶切位點，結(jié)合pCAMBIA1300-GFP載體，選用SalⅠ和SpeⅠ作為融合表達載體構(gòu)建的酶切位點，并設(shè)計上游特異引物SPF1和下游特異引物SPR1進行PCR擴增.雙酶切pCAMBIA1300-GFP空載質(zhì)粒和PCR擴增產(chǎn)物，純化酶切產(chǎn)物并用T4連接酶連接，獲得pCAMBIA1300-LlHsfC1-GFP瞬時表達載體，雙酶切和測序驗證連接是否成功.用基因槍轟擊法[12]將構(gòu)建好的重組瞬時表達載體轟擊到在MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)24 h的洋蔥表皮細胞中，空載作為對照.暗培養(yǎng)24 h后在激光共聚焦顯微鏡(Nikon Eclipse TE2000-E)下進行觀察和拍照，并用EZ-C1軟件對照片進行分析和處理.

1.4 LlHsfC1基因表達分析

選擇生長良好、長勢一致的‘白天堂’組培苗作為基因表達分析的材料.

LlHsfC1在熱激處理下的表達：用37和42 ℃熱激處理百合組培苗，分別在處理1、3、6、12 h取葉片，以22 ℃處理為對照.

LlHsfC1在Ca2+處理下的表達：分別在22和37 ℃下，分別用20 mmol·L-1CaCl2和10 mmmol·L-1EGTA溶液浸沒百合組培苗的根部，用去離子水處理作對照，處理1 h后取葉片.

所取組織用液氮速凍并保存于-80 ℃的超低溫冰箱中備用提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA.采用實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qPCR)的方法檢測基因的表達，步驟參照KAPA SYBR FAST qPCR Universal Kit熒光定量試劑盒說明書，儀器為Applied Biosystems Step One System 熒光定量PCR儀.LlHsfC1的擴增引物為qF1和qR1，內(nèi)參基因18S rRNA的擴增引物為18SqF和18SqR.PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán).每個樣品設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法[13]分析基因的相對表達量.

1.5 植物過表達載體pCAMBIA1301-LlHsfC1的構(gòu)建

利用DNAMAN 5分析LlHsfC1的ORF序列的酶切位點，結(jié)合pCAMBIA1301載體，選用SmaⅠ和SalⅠ作為融合表達載體構(gòu)建的酶切位點.以測序正確的質(zhì)粒為模板，設(shè)計上游特異引物SPF2和下游特異引物SPR2進行PCR擴增，然后連接到pMD18-T載體.雙酶切pCAMBIA1301空載質(zhì)粒和pMD18-T-LlHsfC1質(zhì)粒，純化酶切產(chǎn)物并用T4連接酶連接，獲得pCAMBIA1301-LlHsfC1過表達載體，雙酶切和測序驗證連接是否成功.測序正確的質(zhì)粒用于后續(xù)植物轉(zhuǎn)基因研究.

2 結(jié)果與分析

2.1 百合LlHsfC1基因鑒定及生物信息學(xué)分析

LlHsf1(GenBank登錄號JN792932)ORF區(qū)序列長為780 bp，編碼259個氨基酸(圖1).BLAST的結(jié)果顯示，該基因與其他物種的HsfC1基因有較高的同源性，暫將其命名為LlHsfC1.

圖1 百合LlHsfC1基因開放閱讀框及編碼的氨基酸序列Fig.1 Open reading frame of LlHsfC1 and the predicted amino acid sequences

ProtParam在線工具預(yù)測百合LlHsfC1蛋白包含259個氨基酸殘基，分子式為C1350H2107N381O385S9，分子質(zhì)量為30.1 ku.親水性平均系數(shù)(GRAVY)為-0.536(<0)，屬于親水性蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為64.28(>40)，屬于不穩(wěn)定蛋白，理論等電點(PI)為9.61，屬于堿性蛋白.蛋白質(zhì)磷酸化位點預(yù)測工具NetPhos預(yù)測LlHsfC1含有22個絲氨酸(Ser)和6個蘇氨酸(Thr)潛在磷酸化位點.蛋白質(zhì)亞細胞定位工具PSORT預(yù)測LlHsfC1定位于細胞核內(nèi).

將LlHsfC1及與其相似度較高的其他植物的HsfC1氨基酸序列進行同源比對，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測工具SMART進行分析，結(jié)果表明LlHsfC1蛋白具有C類Hsf的典型結(jié)構(gòu)(圖2A)：在靠近N端18～109個氨基酸殘基形成DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain, DBD)；第124～167個氨基酸殘基形成OD，該寡聚域主要由兩段疏水性氨基酸殘基(hydrophobic amino acid residues A/B, HR-A/B)組成；第178～191個氨基酸殘基形成核定位信號(nuclear localization signal, NLS).與百合A類熱激轉(zhuǎn)錄因子LlHsfA1、LlHsfA2a相比，LlHsfC1缺少AHA模序和核輸出信號(nuclear export signal, NES)(圖2B).

LlHsfC1:Lilium longiflorum百合AEU17861;AcHsfC1:Ananas comosus鳳梨XP_020098172;AtHsfC1:Arabidopsis thaliana擬南芥At3g24520;EgHsfC1:Elaeis guineensis油棕XP_010911318;MaHsfC1:Musa acuminata小果野蕉XP_009415170;PdHsfC1:Phoenix dactylifera海棗XP_008810034.A.百合LlHsfC1與其他植物HsfC1氨基酸序列同源比對;B.百合LlHsfC1與LlHsfA1、LlHsfA2a基本結(jié)構(gòu)比較.圖2 百合LlHsfC1的基本結(jié)構(gòu)Fig.2 Basic structure of LlHsfC1

將百合LlHsfC1及與其同源性較高的其他植物的HsfC1、擬南芥21個Hsf的氨基酸序列，用MEGA 5構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示Hsf家族可分為A、B、C三類，百合LlHsfC1歸屬C類.LlHsfC1與同為單子葉植物的海棗(Phoenixdactylifera)HsfC1的親緣關(guān)系最近(圖3)，相似度達60%.特征結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進化分析的結(jié)果進一步說明LlHsf1基因?qū)儆谥参颒sfC1的同源基因，將其命名為LlHsfC1.

2.2 百合LlHsfC1亞細胞定位

用基因槍將構(gòu)建好的瞬時表達載體pCAMBIA1300-LlHsfC1-GFP轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細胞，空載pCAMBIA1300-GFP為對照，通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的信號.結(jié)果(圖4)顯示，轉(zhuǎn)pCAMBIA1300-GFP載體的洋蔥表皮細胞內(nèi)綠色熒光分布在細胞質(zhì)和細胞核中，在細胞核中檢測到了LlHsfC1-GFP融合蛋白的熒光信號，表明LlHsfC1主要在細胞核中表達，具備轉(zhuǎn)錄因子的基本特征，這與LlHsfC1蛋白含有NLS區(qū)域的特征相符.

2.3 百合LlHsfC1基因的表達分析

利用qPCR檢測LlHsfC1的表達.結(jié)果表明，LlHsfC1的表達受37 ℃和42 ℃熱激誘導(dǎo)，在1～12 h內(nèi)百合葉片中LlHsfC1的相對表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；與42 ℃相比，37 ℃熱脅迫處理更能顯著促進LlHsfC1的持續(xù)表達，處理6 h的表達量約為對照的5.70倍(P<0.05)(圖5，A).常溫條件下，CaCl2或EGTA處理的LlHsfC1的相對表達量與對照差異不顯著(P>0.05)；37 ℃熱脅迫下，CaCl2處理顯著促進了LlHsfC1的表達(P<0.05)，而EGTA處理則顯著抑制了LlHsfC1的表達(P<0.05)(圖5，B)，表明LlHsfC1可以通過Ca2+信號途徑參與百合的熱脅迫反應(yīng).

標尺表示進化距離.節(jié)點處數(shù)值表示bootstrap驗證中基于1000次重復(fù)該節(jié)點可信度的百分比(%).At:Arabidopsis thaliana擬南芥;Ll:Lilium longiflorum百合;Ma:Musa acuminate小果野蕉;Ac:Ananas comosus鳳梨;Eg:Elaeis guineensis油棕;Pd:Phoenix dactylifera海棗.圖3 百合Hsf與其他植物Hsf系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of LlHsf with other plant Hsf

圖4 LlHsfC1在洋蔥表皮中的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of LlHsfC1 in onion epidermal cells

2.4 pCAMBIA1301-LlHsfC1植物過表達載體的構(gòu)建

利用雙酶切方法構(gòu)建了植物過表達載體pCAMBIA1301-LlHsfC1，利用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和SalⅠ將載體切為2個片段，分別為13 246和786 bp，表明載體構(gòu)建成功.

3 討論

目前的研究表明，植物響應(yīng)高溫脅迫的調(diào)控途徑主要有[14]：熱激轉(zhuǎn)錄因子—熱激蛋白(HSF-HSP)途徑、鈣離子—鈣調(diào)蛋白(Ca2+-CaM)途徑、活性氧(ROS)途徑、激素調(diào)控途徑和細胞未折疊蛋白響應(yīng)(UPR)途徑.其中，HSF-HSP途徑是植物響應(yīng)熱脅迫的基本和主要途徑.Hsf的功能與其特殊的蛋白結(jié)構(gòu)密不可分，其主要包括以下幾個重要的結(jié)構(gòu)域[4]：DBD、OD、NLS、NES和激活域(activator domain, AD).N端的DBD負責識別并結(jié)合HSE；OD由HR-A/B組成，負責Hsf在逆境下形成有活性的同源三聚體，根據(jù)OD結(jié)構(gòu)的特征，可將植物Hsfs分為A、B、C三類，A類在HR-A和HR-B之間存在21個氨基酸的插入，C類在此區(qū)域存在7個氨基酸的插入，而B類在此區(qū)域無氨基酸插入；NLS與OD的C端相鄰，是蛋白輸入核內(nèi)所必需的；AD位于C端，它是Hsf中最不保守的部分，其中存在AHA模序，具有轉(zhuǎn)錄激活功能，B類與C類Hsf缺少此結(jié)構(gòu)域；有些Hsf的C末端還具有富含亮氨酸的NES，與蛋白向核外輸出密切相關(guān).本研究的LlHsf1在HR-A和HR-B之間插入了7個氨基酸殘基，不含AHA和NES模序，與HsfC1的同源性較高，因此將其命名為LlHsfC1.LlHsfC1在細胞核中表達，這與其只有NLS的結(jié)構(gòu)和亞細胞定位預(yù)測的結(jié)果相符，可能行使轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄輔激活功能.但是與百合的5個A類Hsf相比[8-11]，LlHsfC1缺少AHA模序，其是否具有轉(zhuǎn)錄激活功能，還需要進一步研究.

*表示各點與對照的表達量在P<0.05水平差異顯著;A.葉片LlHsfC1在37 ℃和42 ℃熱激處理下的表達;B.葉片LlHsfC1受Ca2+處理的表達.圖5 LlHsfC1在百合中的表達模式分析Fig.5 Analysis of the expression pattern of LlHsfC1 in lily

M:1 kb DNA Ladder Marker;A:SmaⅠ/SalⅠ酶切片段.圖6 pCAMBIA1301-LlHsfC1的酶切鑒定Fig.6 Restriction enzyme digestion of pCAMBIA1301-LlHsfC1

A類Hsf含有AHA模序而通常具有轉(zhuǎn)錄激活活性.因此，對于植物Hsfs的研究多集中在A類Hsf上：與野生型相比，擬南芥hsfa1a/b/d/e四突變體對高溫更加敏感，相關(guān)熱響應(yīng)基因表達顯著下調(diào)[5]；番茄HsfA2嚴格受熱激誘導(dǎo)，它在熱脅迫和恢復(fù)循環(huán)中具有較高的激活潛力，并且能誘導(dǎo)Hsp的連續(xù)積累[6]；大豆GmHsfA1轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性明顯高于野生型[7]；擬南芥中過表達百合LlHsfA3a增強了植株的基礎(chǔ)和獲得耐熱性，而過表達LlHsadfA3b提高了植株的獲得耐熱性[11].近年來，越來越多的證據(jù)表明植物B類和C類Hsfs在植物響應(yīng)高溫脅迫的過程中也發(fā)揮著重要作用.番茄HsfB1是HsfA1的共激活因子，具有輔助激活的功能[15]，但擬南芥HsfB1卻是A類Hsf的共抑制因子[16].小麥B2亞家族Hsf基因TaHsf3的表達受熱激誘導(dǎo)，在擬南芥中過量表達TaHsf3可提高擬南芥Hsp70的表達水平并顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性[17].雙子葉植物中C類Hsfs一般由1～2個成員組成，如擬南芥、楊樹、番茄均含有1個，而單子葉植物一般由3～5個成員組成，如水稻含有4個，玉米含有5個[18].單子葉植物中C類Hsfs更具復(fù)雜性，暗示C類Hsfs在單子葉植物中扮演更重要的角色.例如水稻OsHsfC1b[19]、大白菜C類Hsf基因BraHsf039[20]、小麥TaHsfC2a受熱脅迫誘導(dǎo)表達，TaHsfC2a能夠轉(zhuǎn)錄激活一些熱響應(yīng)基因的表達，提高轉(zhuǎn)基因小麥的耐熱性[21].本研究中，LlHsfC1的表達受熱激誘導(dǎo)，但與42 ℃的脅迫溫度相比，LlHsfC1對37 ℃的響應(yīng)更加迅速、顯著和持久，這與對LlHsfA3a和LlHsfA3b的研究結(jié)果類似[11].Zhou et al[22]提出了植物熱激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Ca2+-CaM-HSF途徑.在前期研究中表明，Ca2+/LlCaM3可能在HsfA1的上游調(diào)控百合耐熱性[2].因此研究了CaCl2、鈣離子螯合劑EGTA處理對LlHsfC1表達的影響，發(fā)現(xiàn)LlHsfC1的表達受熱脅迫與Ca2+處理協(xié)同誘導(dǎo)，表明LlHsfC1也可能通過Ca2+信號途徑參與百合的HSR.

亞細胞定位與基因表達的結(jié)果表明LlHsfC1可能與百合的HSR密切相關(guān)，但是還需要進一步在模式植物和百合上分析基因功能.本研究構(gòu)建了植物過表達載體pCAMBIA1301-LlHsfC1，為后續(xù)通過轉(zhuǎn)基因來研究LlHsfC1的功能奠定了基礎(chǔ).