楊安源 ，胡恩燁 ，周紅軍，2，周新華 ，2，舒緒剛 ，2

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,廣東 廣州 510225；2.廣東省普通高校農(nóng)用綠色精細(xì)化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510225）

硒是人和動(dòng)物必需的微量元素之一，參與人和動(dòng)物機(jī)體的各項(xiàng)代謝［1-2］，具有重要的生物學(xué)作用，而且硒具有抗氧化、抗病毒、抗衰老、抗癌、調(diào)節(jié)免疫等作用，可防治克山病［3］、心腦血管疾病和腫瘤等諸多疾病［4］。因此，適當(dāng)補(bǔ)充硒元素對(duì)人和動(dòng)物的健康均起到積極意義。動(dòng)物主要通過口服和靜脈注射等途徑進(jìn)行補(bǔ)硒，其中口服硒營養(yǎng)劑是動(dòng)物補(bǔ)硒較為常用的方法。而價(jià)廉易得的亞硒酸鈉是一種被廣泛使用的口服硒營養(yǎng)劑。但由于亞硒酸鈉穩(wěn)定性欠佳，在一定條件下可與飼料中的還原性物質(zhì)（如維生素C）發(fā)生氧化還原反應(yīng)［5］，導(dǎo)致硒元素在飼料儲(chǔ)藏、使用過程中流失嚴(yán)重。同時(shí)，亞硒酸鈉在反應(yīng)過程中會(huì)對(duì)飼料品質(zhì)及營養(yǎng)價(jià)值產(chǎn)生潛在的負(fù)面影響。因此，人們往往需向飼料添加過量的亞硒酸鈉，以確保動(dòng)物攝入足夠的硒元素。然而亞硒酸鈉的過量攝入會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體中毒，甚至死亡［6］。同時(shí)，過量使用亞硒酸鈉對(duì)環(huán)境存在潛在污染。綜上，亞硒酸鈉的性質(zhì)限制了其在飼料硒營養(yǎng)劑的高效利用。目前，研究者主要通過改善亞硒酸鈉在飼料中的穩(wěn)定性，進(jìn)而提高其在飼料中的利用效率。

研究表明，微膠囊技術(shù)可以有效改善物質(zhì)的穩(wěn)定性，提高物質(zhì)的利用效率。目前，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品［7］、漁業(yè)［8］和飼料加工［9］等行業(yè)。研究者已開發(fā)出不同的微膠囊制備方法。He等［10］采用噴霧干燥法，制備了辛烯基琥珀酸淀粉和黃原膠包埋共軛亞油酸緩釋微膠囊。Liu等［11］通過靜電沉積法，制備了高細(xì)胞密度藻酸鹽-聚-L-賴氨酸（PLL）微膠囊。Lupo等［12］采用內(nèi)源乳化法，制備了以海藻酸鈉為壁材、可可為芯材的微膠囊。其中，內(nèi)源乳化法因工藝簡單、設(shè)備簡易、制備條件溫和等優(yōu)點(diǎn)而備受研究者關(guān)注。該法的成囊材料海藻酸鈉是一種聚陰離子型天然高分子，其結(jié)構(gòu)是由α-L-古洛糖醛酸（G）和β-D-甘露糖醛酸（M）通過（1→4）連接形成的線性嵌段共聚物。其中G嵌段可與Ca2+、Pb2+、Ba2+等二價(jià)陽離子發(fā)生膠凝，形成“蛋格”結(jié)構(gòu)［13］。海藻酸鈉凝膠在改善物質(zhì)穩(wěn)定性方面有著廣泛應(yīng)用［14-15］。

為改善亞硒酸鈉在飼料中的穩(wěn)定性，降低其對(duì)環(huán)境的污染，本研究以亞硒酸鈉為芯材、海藻酸鈉為壁材，通過內(nèi)源乳化法制備亞硒酸鈉/海藻酸鈉微膠囊（sodium selenite/sodium alginate microcapsules， SSSAM）。借助傅立葉紅外和X射線衍射儀對(duì)SSSAM的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以SSSAM的載藥率（LC）和包封率（EE）為指標(biāo)，優(yōu)化SSSAM的制備工藝，以期獲得高LC和EE的SSSAM，為后續(xù)進(jìn)一步探究SSSAM的相關(guān)性能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

海藻酸鈉（SA，化學(xué)純），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；98%亞硒酸鈉，購自西亞化學(xué)試劑廠；納米碳酸鈣（Nano-CaCO3，化學(xué)純），≤19 μm，購自佛山市源磊粉體有限公司；Span 80（化學(xué)純），購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；冰醋酸（分析純），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；液體石蠟（化學(xué)純）、無水乙醇（分析純），購自天津富宇精細(xì)化工有限公司；硫代硫酸鈉、碘化鉀（分析純），購自廣州光華化學(xué)試劑廠。

主要試驗(yàn)儀器有Spectrum 100型傅立葉變換紅外光譜儀（Fourier Transform infrared spectroscopy， FTIR，美國PerkinElmer公司）、布魯克D8 Advance型X射線衍射儀（X-ray Powder diffractometer， XRD，德國Bruker公司）。

1.2 亞硒酸鈉/海藻酸鈉微膠囊的制備

稱取1.8 g SA與0.9 g Nano-CaCO3于燒杯中，加入100 mL去離子水，攪拌過夜，作為水相。量取150 mL液體石蠟于燒杯中，加入2%（W/W）Span 80和0.6 g Na2SeO3，乳化30 min，作為油相。取50 mL水相滴加到油相中，持續(xù)攪拌90 min；緩慢加入2 mL冰醋酸，持續(xù)攪拌40 min；過濾后用無水乙醇洗滌至試樣表面不出現(xiàn)油層，75℃干燥12 h，常溫真空干燥至無油狀液滴出現(xiàn)。依次改變表1中SSSAM的制備工藝，以載藥率（LC）和包封率（EE）為指標(biāo)，優(yōu)化SSSAM制備工藝，探索制備工藝對(duì)LC和EE的影響規(guī)律。同時(shí)制備SA微膠囊（SAM），除不加Na2SeO3外，其他步驟參照SSSAM制備方法。

表1 SSSAM的制備工藝單因素水平設(shè)置

1.3 亞硒酸鈉/海藻酸鈉微膠囊結(jié)構(gòu)表征

采用傅立葉紅外光譜儀，利用KBr壓片法對(duì)樣品結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，掃描波數(shù)范圍為4 000～500 cm-1；采用X射線衍射儀分析樣品的晶體結(jié)構(gòu)，測試條件為：LynxEye陣列探測器，電壓40 kV，電流40 mA，步長0.02°，測試速度0.1 s/step，銅靶，入射線波長0.15418 nm。

1.4 亞硒酸鈉/海藻酸鈉微膠囊載藥率和包封率的測定

0.100 mol/L硫代硫酸鈉溶液的配制、標(biāo)定及稀釋參照文獻(xiàn)［16］中相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。SSSAM的LC測定參照文獻(xiàn)［17］稍作調(diào)整。準(zhǔn)確稱取0.5 g SSSAM于燒杯中，加適量去離子水煮沸攪拌8 h，過濾濃縮，用去離子水定容至100 mL，移取該溶液25 mL置于碘量瓶中，加入40 mL去離子水、3 mol/L鹽酸溶液10 mL，用0.100 mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定，近終點(diǎn)時(shí)加0.1 mol/L碘化鉀溶液（現(xiàn)配）2 mL，再加5 g/L淀粉指示液（現(xiàn)配）2 mL，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失，同時(shí)做空白試驗(yàn)。其離子反應(yīng)方程式如下：

由上述試驗(yàn)步驟及離子反應(yīng)方程式可得到SSSAM的LC計(jì)算公式：

式中，V1為試樣消耗硫代硫酸鈉體積（mL），V0為試劑空白消耗硫代硫酸鈉體積（mL），m為試樣質(zhì)量（g），0.04323為硫代硫酸鈉與亞硒酸鈉轉(zhuǎn)換系數(shù)，c為硫代硫酸鈉實(shí)際濃度（mol/L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Na2SeO3、SAM和SSSAM的FTIR分析

從圖1可見，譜線Na2SeO3在730 cm-1附近出現(xiàn)明顯的尖峰，是SeO32-的伸縮振動(dòng)吸收峰。譜線SAM在3 340 cm-1附近出現(xiàn)一個(gè)寬的吸收帶，此為SA的-OH伸縮振動(dòng)峰；在2 926 cm-1附近出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，此為-CH2的伸縮振動(dòng)峰；在1 626 cm-1處為羰基的伸縮振動(dòng)峰，這一系列吸收峰為SA的紅外特征吸收峰。譜線SSSAM在3 340、2 926、1 625 cm-1處的特征吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，此為SeO32-與SA間存在較強(qiáng)的分子間相互作用所致。對(duì)比前二者可以看出，譜線SSSAM在730 cm-1附近出現(xiàn)了SeO32-的吸收峰，故在該試驗(yàn)條件下，Na2SeO3已負(fù)載至微膠囊上。

圖1 Na2SeO3、SAM和SSSAM的FTIR分析結(jié)果

2.2 Na2SeO3、SAM和SSSAM的XRD分析

圖2 中自上而下依次為SSSAM、SAM、Na2SeO3以及Na2SeO3標(biāo)準(zhǔn)卡的XRD譜圖。Na2SeO3標(biāo)準(zhǔn)卡在2θ為21.98、24.18、25.98和37.60處出現(xiàn)強(qiáng)衍射峰，表明Na2SeO3以晶體形式存在；Na2SeO3樣品在2θ為22.03、24.23、26.01和37.66處出現(xiàn)相似的衍射峰。而樣品SSSAM和SAM的XRD衍射譜線相似，均無強(qiáng)衍射峰出現(xiàn)。結(jié)合FTIR分析結(jié)果可知，SSSAM對(duì)Na2SeO3包埋，Na2SeO3由晶態(tài)向非晶態(tài)轉(zhuǎn)變。

圖2 Na2SeO3、SAMC和SSSAM的XRD分析結(jié)果

2.3 亞硒酸鈉/海藻酸鈉微膠囊制備工藝對(duì)LC和EE的影響

2.3.1 Nano-CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)SSSAM LC和EE的影響 只改變Nano-CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其余制備條件不變，結(jié)果SSSAM的LC隨Nano-CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而下降，EE隨Nano-CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而先增后降。由于Nano-CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，在改變體系pH過程中，SA液滴內(nèi)部產(chǎn)生過量的CO2，漲破SA微膠囊使得部分溶解在SA液滴內(nèi)部的SeO32-隨水分蒸發(fā)流失，導(dǎo)致其LC下降。而SSSAM的EE出現(xiàn)先升后降的趨勢，可能是增加Nano-CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)后SSSAM的理論LC下降，SSSAM的EE計(jì)算式中分母減少，導(dǎo)致EE增大。綜合考慮SSSAM的LC與EE間關(guān)系，在此試驗(yàn)條件下，制備SSSAM以選取Nano-CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)為SA的1/2較適宜。

圖3 Nano-CaCO3質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)SSSAM LC和EE的影響

2.3.2 油水體積比對(duì)SSSAM LC和EE的影響只改變體系油水體積比，其余制備條件不變。SSSAM的LC和EE隨油水體積比增大呈先增后降趨勢，當(dāng)油水體積比達(dá)到4:1時(shí)其LC和EE均達(dá)到極值。增加油相體積能有效降低SA液滴的粒徑，增加SA液滴的比表面積，進(jìn)而提高SA液滴與Na2SeO3的接觸幾率，提高SSSAM的LC和EE。但油水體積比超過4:1后，液體石蠟在攪拌過程中被帶入到微膠囊內(nèi)部，破壞微膠囊結(jié)構(gòu)，使Na2SeO3部分流失至油相中；同時(shí)，隨油相體積不斷增加，SA液滴與Na2SeO3的接觸幾率逐漸受油相體積控制，使SA液滴與Na2SeO3的接觸幾率下降，導(dǎo)致SSSAM的LC和EE下降。因此，在此試驗(yàn)條件下，制備SSSAM以選取油水體積比為4:1較適宜。

2.3.3 Span 80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)SSSAM LC和EE的影響 只改變體系中Span 80質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其余制備條件不變。SSSAM的LC和EE隨Span 80質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大呈先增后降趨勢，當(dāng)Span 80質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到為液體石蠟的3%時(shí)，其LC和EE均達(dá)到極值。乳化劑Span 80加入油相后能有效降低SA液滴的粒徑，增大SA液滴的比表面積，增加SA液滴與Na2SeO3的接觸幾率，提高SSSAM的LC和EE。但Span 80質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過液體石蠟的3%后，此時(shí)SA液滴對(duì)Na2SeO3的接觸效率主導(dǎo)SSSAM的LC和EE。SA液滴粒徑持續(xù)下降，SA液滴與Na2SeO3間相對(duì)速率下降，二者接觸效率降低，導(dǎo)致SSSAM的LC和EE下降。因此，在此試驗(yàn)條件下，制備SSSAM以選取乳化劑Span 80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為液體石蠟的3%較適宜。

圖5 Span 80質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)SSSAM LC和EE的影響

2.3.4 乳化時(shí)間對(duì)SSSAM LC和EE的影響 只改變體系中的乳化時(shí)間，其余制備條件不變。SSSAM的LC和EE隨乳化時(shí)間延長呈先增后降趨勢，當(dāng)乳化時(shí)間為40 min時(shí)，SSSAM的LC和EE均達(dá)到最大值。乳化時(shí)間低于40 min時(shí)，SA液滴與Na2SeO3的接觸幾率是影響SSSAM LC和EE的主導(dǎo)因素。SA液滴的粒徑隨乳化時(shí)間延長而下降，SA液滴的比表面積隨SA液滴粒徑下降而增加，SA液滴與Na2SeO3接觸幾率增加，進(jìn)而提高SSSAM的LC和EE。但乳化時(shí)間超過40 min后，此時(shí)SA液滴與Na2SeO3的接觸效率主導(dǎo)SSSAM的LC和EE。SA液滴粒徑持續(xù)下降，SA液滴與Na2SeO3間相對(duì)速度差縮小，SA液滴截留Na2SeO3的能力下降，二者的有效接觸降低，導(dǎo)致SSSAM的LC和EE下降。因此，在此試驗(yàn)條件下，制備SSSAM以選取乳化時(shí)間為40 min較適宜。

圖6 乳化時(shí)間對(duì)SSSAM LC和EE的影響

2.3.5 交聯(lián)時(shí)間對(duì)SSSAM LC和EE的影響 只改變體系中的交聯(lián)時(shí)間，其余制備條件不變。SSSAM的LC和EE隨交聯(lián)時(shí)間延長而下降趨勢，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為15 min時(shí)，SSSAM的LC和EE均達(dá)到極大值。加入冰醋酸后，體系pH值迅速下降，SSSAM液滴表面形成凝膠薄膜，阻止油相中的Na2SeO3繼續(xù)鑲嵌到SA液滴表面；同時(shí)凝膠薄膜阻礙了外部H+滲透至SA內(nèi)部，導(dǎo)致SSSAM出現(xiàn)外部緊密而內(nèi)部疏松的結(jié)構(gòu)。隨著交聯(lián)時(shí)間延長，溶解在SSSAM內(nèi)部未固定的SeO32-沿著SSSAM的孔道、孔隙重新釋放至油相中，交聯(lián)時(shí)間越長，SSSAM中的SeO32-流失率越高，造成SSSAM的LC和EE下降。因此，在該試驗(yàn)條件下，制備SSSAM以選取交聯(lián)時(shí)間為15 min較為適宜。

圖7 交聯(lián)時(shí)間對(duì)SSSAM LC和EE的影響

3 結(jié)論與討論

硒的生物學(xué)意義早已得到各界的認(rèn)可［18-19］。我國是世界上較為缺硒的國家之一，且國內(nèi)硒元素分布不均，國民硒營養(yǎng)攝入明顯不足，需要通過其他途徑額外補(bǔ)硒，其中一個(gè)重要補(bǔ)硒途徑是通過食用富硒動(dòng)植物。亞硒酸鈉是目前國內(nèi)飼料行業(yè)使用較為廣泛的硒營養(yǎng)劑。但是亞硒酸鈉穩(wěn)定性欠佳，在應(yīng)用過程中對(duì)飼料品質(zhì)和環(huán)境都存在潛在的不良影響。同時(shí)，亞硒酸鈉服用過量會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體中毒甚至死亡［6］。目前，采用技術(shù)途徑提高亞硒酸鈉在飼料中的穩(wěn)定性，是解決上述問題的重要途徑。研究表明，微膠囊技術(shù)是提高藥物穩(wěn)定性的有效方法。Sanna等［20］采用雙乳液法制備了負(fù)載白藜蘆醇微膠囊，結(jié)果顯示白藜蘆醇經(jīng)過微膠囊化后穩(wěn)定性顯著提高。 Albadran等［21］對(duì)植物乳桿菌在干燥微膠囊中加速貯存的穩(wěn)定性進(jìn)行了探究，結(jié)果表明微膠囊結(jié)構(gòu)能提高植物乳桿菌的穩(wěn)定性。徐華等［22］以乙基纖維素為壁材、毒死蜱為模型藥物，采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備毒死蜱/乙基纖維素微膠囊，該微膠囊具有良好的緩釋性能。微膠囊技術(shù)確能有效提高藥物的穩(wěn)定性，增強(qiáng)藥物在應(yīng)用過程中的可控性，顯著降低藥物用量。

本研究采用內(nèi)源乳化法成功制備負(fù)載Na2SeO3的海藻酸鈉微膠囊。FTIR和XRD 分析表明：Na2SeO3以物理包埋的形成存在于SSSAM中，并且晶態(tài)Na2SeO3在包埋至SSSAM過程中，Na2SeO3在海藻酸鈉與液體石蠟間界面發(fā)生溶解，在交聯(lián)和干燥過程中轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)的Na2SeO3。通過單因素法，以SSSAM的LC和EE為指標(biāo)，優(yōu)化其制備工藝：Nano-CaCO3質(zhì)量比為1/2，油水體積比為4:1，Span 80質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，乳化40 min，交聯(lián)15 min。在此條件下，SSSAM的LC和EE分別為16.2%和52.7%。SSSAM可替代Na2SeO3作為硒營養(yǎng)劑添加到飼料中。而SSSAM在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性及模擬環(huán)境中的釋放有待后續(xù)進(jìn)一步探討。