陳梅 ，劉清波 ，江寧 ，王偉紅 ，劉靜 ，黃萍 ，孫茂

1.唐山工人醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北唐山 063000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710032

苯丙酮尿癥（Phenylketonuria,PKU,OMIM261600）是遺傳代謝病中常見的常染色體隱性遺傳病，上世紀(jì)30年代因佛倫醫(yī)生(Folling)發(fā)現(xiàn)患者尿液中含有大量的苯丙酮酸而得名[1]。經(jīng)過科研人員的研究苯丙酮尿癥的發(fā)病機(jī)制已經(jīng)很明確，其中≥90%是由于苯丙氨酸羥化酶（Phenylalaine hydorxylase,PAH）基因突變導(dǎo)致肝臟內(nèi)酶活性降低或缺乏，≤10%是由于PAH的的輔酶四氫生物蝶呤 （Tetrahydrobiopterin,BH4）缺乏，兩種情況都會造成苯丙氨酸（Phenylalanine,Phe）無法正常轉(zhuǎn)化為酪氨酸（Tyrosine,Tyr），從而開啟旁路代謝，產(chǎn)生大量的苯丙酮酸，并在體內(nèi)異常蓄積，導(dǎo)致疾病發(fā)生。苯丙酮尿癥其發(fā)病率因人群和地域而異，我國發(fā)病率約為1/11307[2]。如延誤診治，會造成患者神經(jīng)系統(tǒng)不可逆損害，嚴(yán)重影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和兒童的智力發(fā)育。該文回顧性分析2016年1月—2017年4月，通過該院DNA分型中心篩查的3 593例高危兒中確診的8例苯丙酮尿癥患兒情況，并結(jié)合分析了國外和國內(nèi)的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期加強(qiáng)臨床醫(yī)生對苯丙酮尿癥的認(rèn)識，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該次檢測在3 593例高危兒中檢出8例PKU患兒，男3例，女5例，年齡1歲以下6例，8～10歲2例。在新生兒苯丙酮尿癥和先天性甲狀腺功能減低癥篩查中得到PKU異常，進(jìn)一步通過遺傳代謝篩查（血液氨基酸和?；鈮A檢測、尿液有機(jī)酸檢測）和基因診斷確診苯丙酮尿癥。該研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會通過，篩查人群（或監(jiān)護(hù)人）都簽署知情同意書。

1.2 研究方法

①液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）進(jìn)行血液氨基酸和?；鈮A檢測。

②氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）進(jìn)行尿液有機(jī)酸檢測。

③基因診斷?；蚪MDNA的提取；PCR擴(kuò)增，PAH基因的引物序列參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[3]，反應(yīng)總體積為25 μL，循環(huán)條件為97℃ 5 min預(yù)變性，共35個(gè)循環(huán)（包括 94℃45s，55℃45s，72℃45s），72 ℃延伸 10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 代謝篩查結(jié)果分析

8例患兒遺傳代謝篩查結(jié)果見表1，其中2例在血液氨基酸、?；鈮A檢測和尿液有機(jī)酸檢測中都檢出了相關(guān)物質(zhì)，分別是患兒4：Phe為364.996 μM，尿液中檢出苯乙酸 （Phenylacetic acid）； 患兒5：Phe為954.070 μM，尿液中檢測出苯乳酸（Phenyl lactate）和苯乙酸；6例在血液氨基酸和肉堿檢測中Phe不同程度的上升，而尿液有機(jī)酸檢測未見相關(guān)物質(zhì)，3例未知。

表1 遺傳代謝篩查結(jié)果

2.2 基因檢測結(jié)果分析

8例患兒基因檢測結(jié)果見表2，PAH共檢測出7種突變類型，分別是內(nèi)含子4上的剪接突變c.442-1G＞A， 外顯子 7 上的錯(cuò)義突變 c.721C＞T、c.728G＞A和終止突變c.781C＞T，外顯子12上的錯(cuò)義突變c.1238G＞C、c.1256A＞G、c.1301G＞A。所有基因檢測都對其父母進(jìn)行了檢測，證實(shí)了共分離。

表2 代謝篩查和基因診斷結(jié)果

3 討論

苯丙酮尿癥其發(fā)病機(jī)制見圖1，當(dāng)苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酪氨酸在體內(nèi)異常蓄積，產(chǎn)生對人體有損害的苯丙酮酸和一系列旁路代謝產(chǎn)物，如苯乙酸、苯乳酸（患兒特征性的鼠尿味就是旁路代謝產(chǎn)物中的苯乳酸），會引起一系列神經(jīng)系統(tǒng)損害。由于苯丙氨酸羥化酶只在肝臟細(xì)胞中表達(dá)，而在羊水和絨毛細(xì)胞中不表達(dá)，所以新生兒遺傳代謝病篩查和基因診斷是實(shí)現(xiàn)疾病早期診斷的的有效手段[4]。通過研究PAH基因的突變譜，可以有效探究PAH基因型和臨床表型的相關(guān)聯(lián)性，也為研究苯丙酮尿癥的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷打下了基礎(chǔ)。

圖1 苯丙氨酸羥化酶的代謝圖

1983年科學(xué)家首次分離出了人類PAH基因，這為苯丙酮尿癥的基因診斷奠定了基礎(chǔ)。PAH基因位于12號染色體的長臂q22-q24.1，全長約100 kb，編碼區(qū)包含13個(gè)外顯子。迄今為止科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一千余種突變，85%位于編碼區(qū)的外顯子上，15%位于內(nèi)含子區(qū)、3’和5’區(qū)；根據(jù)對PAH酶活性有無影響，基因突變分為沉默突變和致病性突變。沉默突變顧名思義是對PAH酶活性無影響，而致病性突變多位于外顯子、外顯子和內(nèi)含子的交接部分，突變直接影響PAH基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA的翻譯以及蛋白質(zhì)的折疊與聚合的異常，進(jìn)而影響酶的催化活性。

該研究共檢測出7種突變類型，分別是內(nèi)含子4上 c.442-1G＞A， 外顯子 7 上的 c.721C＞T、c.728G＞A和 c.781C＞T，外顯子 12上的 c.1238G＞C、c.1256A＞G、c.1301G＞A，突變種類最多的集中在第7和12外顯子，這與世界范圍內(nèi)突變最多的是PAH基因第7外顯子，集中了大約16%的突變是一致的；因?yàn)榈?外顯子是編碼PAH蛋白核心功能區(qū)，對保持該酶活性起關(guān)鍵性作用。

該研究突變次數(shù)最多的是c.728G＞A共突變4次，該突變位點(diǎn)在中國人群中是高頻突變位點(diǎn)，占總突變的18%[5]，東北人中的頻率18%，山西接近19%，南方人群略低9.5%，該位點(diǎn)已被證實(shí)為致病性突變[6]。東歐最常見的為第12外顯子的c.1223G＞A（R408W），俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)占63%；第5外顯子的c.473G＞A（R158Q）基因突變在歐洲及拉美等國極為普遍，如荷蘭的發(fā)生率為13.0%、比利時(shí)為9.0%、波蘭、匈牙利、德國和捷克等國發(fā)生率都在5.0%以上[7]，但該突變在中國突變頻率卻較低，只有0.8%。美國最常見的突變位點(diǎn)是 c.1241A＞G（Y414C），約占 18.7%，這些說明PAH基因突變呈現(xiàn)高度種族和地區(qū)差異，熱點(diǎn)突變在不同種族、不同地區(qū)均有不同。

亞洲PAH基因突變與歐美國家存在很大差異，日本苯丙酮尿癥的發(fā)病率為1/78 400，最高頻的突變是 c.1238G＞C（R413P），占 30.5%；韓國苯丙酮尿癥的發(fā)病率為 1/41 000，最高頻的突變是 c.728G＞A（R243Q），占12%[8]；臺灣地區(qū)苯丙酮尿癥的發(fā)病率為1/55077，最高頻的突變是 c.721C＞T（R241C），占 32%[8]。

苯丙酮尿癥患兒由于在新生兒期缺乏明顯的特異癥，這就給臨床醫(yī)生的早期診治帶來了困難，1953年德國Bickel醫(yī)生首先應(yīng)用了低Phe飲食治療法獲得成功，迄今該療法仍然是治療PKU最有效的方法。低Phe飲食療法的治療原則是既要使Phe的攝入量保證患兒生長發(fā)育和體內(nèi)代謝的最低需要，又不使血中Phe過高。治療過程中應(yīng)給予特殊的低Phe奶粉，再配合其他低蛋白質(zhì)食物和少量乳類，以達(dá)到最佳效果。值得注意的一點(diǎn)是，由于母乳中Phe的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)比其他食物要低，所以適當(dāng)?shù)拇钆淠溉槲桂B(yǎng)，也是有助于苯丙酮尿癥患兒生長和發(fā)育的。近年也有研究學(xué)者不斷提出新的治療策略：如PKU特殊奶粉中加入L-肉堿；大分子中性氨基酸 （large neutral amino acids，LNAAs）的補(bǔ)充降低血 Phe濃度等[9-10]。 治療過程中定期的監(jiān)控是不可避免的，血液中Phe濃度檢測是患兒近期飲食治療控制情況的重要客觀指標(biāo)，不斷的根據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)和各項(xiàng)檢測指標(biāo)，隨時(shí)修改患兒的治療方案，同時(shí)嚴(yán)密監(jiān)測患兒體格、生長發(fā)育以及智力能力水平，進(jìn)行有效的干預(yù)指導(dǎo)。