李永波

（黔南民族師范學(xué)院， 貴州 都勻 558000）

火龍果（Pitaya）別稱紅龍果、玉龍果、仙蜜桃，由于外表皮肉質(zhì)鱗片化與蛟龍外鱗相似而得名，是仙人掌科三角柱屬（量天尺屬）的果實，主要品種分為紅皮紅肉，紅皮白肉，黃皮白肉3種。[1]在泰國、越南等分布較廣，在我國主要分布在臺灣、廣西、云南、福建、貴州等地。[2]紅龍果是一種高營養(yǎng)、低熱量的熱帶水果。[2]英國醫(yī)生Nidduos寫道，“火龍果屬于高纖維素、低脂肪、低糖類的‘一高,兩低’保健食品。[3]”火龍果果肉營養(yǎng)豐富，療效獨特，具有較高的治療價值，對降血壓、降血脂、解毒、養(yǎng)肺、養(yǎng)顏、改善視力等功效，對糖尿病和便秘也都有效，[4]并且紅肉火龍果還含一般水果所沒有的植物性白蛋白、花青素和水溶性維生素等。其中白蛋白具有解重金屬中毒的作用，[5]花青素具有抗氧化的效用，可以有效防止血管硬化，可以對抗自由基，抵抗衰老。[2]根據(jù)科學(xué)分析，新鮮火龍果肉每100g主要成分包含水分80-85g，總糖9-13g，總酸 0.3-0.5g，灰分 0.34g，粗脂肪 0.17g，粗纖維1.21g。[6]火龍果果實擁有獨特的外形，含有豐富的維生素C、B族維生素，膳食纖維，植物蛋白及鐵、磷、鎂等金屬元素,開展紅肉火龍果保健果酒加工技術(shù)研究可以為火龍果果酒產(chǎn)品的開發(fā)探索經(jīng)驗，為生產(chǎn)企業(yè)加工釀造火龍果果酒產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)，探索火龍果深加工，帶動地方經(jīng)濟的發(fā)展,提高紅肉火龍果產(chǎn)品的附加值，在本次試驗用的紅肉火龍果產(chǎn)自貴州羅甸縣。

1 材料與方法

1.1 材料與藥品

紅肉火龍果（紅皮紅肉）貴州省都勻市羅甸縣；帝伯仕果酒專用酵母（紅）由煙臺帝伯仕酵母有限公司生產(chǎn)；馬鈴薯、白砂糖超市購買；葡萄糖（濟寧宏明化學(xué)試劑有限公司）；瓊脂（常州通城化工有限公司）；無水乙醇（南京化學(xué)試劑股份有限公司）；蒽酮試劑；茚三酮；甘氨酸；NaOH；醋酸；酚酞(化學(xué)藥品為分析純)

1.2 實驗儀器與設(shè)備

LT502E型電子天平 常熟市天量儀器有限公司；

TCL16M型臺式高速冷凍離心機 長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；

YXQ-LS-100G型高壓蒸汽滅菌鍋 上海道基科學(xué)儀器有限公司；

IQS-1807型電陶爐 佛山市順德區(qū)艾瑪詩電器有限公司；

GZX-9140MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

HS-1300-U型潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

ZHWY-211B型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司；

ZXDP-A2080型十段編程電熱恒溫培養(yǎng)箱上海智誠分析儀器制造有限公司；

精密酒精計 翼州市耀華器械儀表廠；

UV-721C型紫外-可見分光光度計 上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 火龍果果酒釀造工藝流程

將新鮮成熟的紅肉火龍果消毒后無菌操作去皮，裝罐。處理組放入用紅肉紅龍果液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的帝伯仕果酒專用酵母（紅），對照組自然發(fā)酵，置于25℃的恒溫箱中進行發(fā)酵。衛(wèi)生指標(biāo)：細菌總數(shù)≤50cfu/mL；大腸菌數(shù)≤3MPN/100ml[7]。

1.3.2 發(fā)酵果酒的取樣方法

在果酒發(fā)酵的第五天，從有明顯的酒味，發(fā)酵正常的組開始取樣，取樣間隔時間為24小時，每次取樣5ml，分別為上、中、下層液面各取一管。平板培養(yǎng)培養(yǎng)樣液。酵母計數(shù)按照GB4789.15馬鈴薯-葡萄糖瓊脂計數(shù)法測定,酵母細胞形態(tài)以呂氏堿性美藍染液染色鏡檢為準(zhǔn)。

用平板涂布計數(shù)時，可以先用肉眼直接觀察并記錄較大的菌落，菌落較小的情況下借助放大鏡輔助觀察，記錄下最終的酵母菌數(shù)與其相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，以菌落的形成單位（cfu）來表示，選取菌落數(shù)在10cfu-150cfu之間的平板計菌落數(shù)取其平均值[8]。

1.3.3 養(yǎng)分測定

1.3.3.1 茚三酮比色法測定游離氨基酸[9]

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:1.分別取0.3mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL 于試管中，用水補足至1mL。各加入1mLpH5.4，2mol/L醋酸緩沖液；再加入1mL茚三酮顯色液，充分混勻后，蓋住試管口，在100℃水浴中加熱15min，用自來水冷卻。放置5min后，加入3mL60%乙醇稀釋，充分搖勻，用分光光度計測定OD570nm。（脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應(yīng)呈黃色，測定OD440nm）。以O(shè)D570nm為縱坐標(biāo)，氨基酸含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)氨基酸茚三酮溶液與氨基酸共熱，生成氨。而氨與茚三酮和還原性茚三酮反應(yīng)，生成紫色化合物。該化合物顏色的深淺與氨基酸的含量成正比，通過測定570nm處的光密度，從而測定氨基酸的含量。2.氨基酸樣品的測定:取樣品液1mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸緩沖液1mL和茚三酮顯色液1mL，混勻后于100℃沸水浴中加熱15min，自來水冷卻。放置5min后，加3mL60%乙醇稀釋，搖勻后測定OD570nm（生成的顏色在60min內(nèi)穩(wěn)定）。將樣品測定的OD570nm與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，計算樣品中氨基酸含量。

1.3.3.2 總糖的測定：采用蒽酮硫酸比色法[10]

1.3.3.3 總酸的測定：采用標(biāo)準(zhǔn)堿液滴定法

吸取待測紅肉火龍果果酒2mL和水50mL置于250mL三角瓶中，加入2滴酚酞指示液，搖勻后，接著用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至終點，并保持30s內(nèi)不變色，最后記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積（V1）。同時做一組空白對照。

1.3.3.4 酒精計來測定酒精度[10]

在標(biāo)準(zhǔn)的溫度下（20度）將酒精計垂直放入紅肉火龍果待測液中，等其穩(wěn)定之后，讀取酒精計上的上面和液面平齊的讀數(shù)就為所測酒精含量。

1.3.3.5 感官評價

紫外-可見分光光度計室溫測定離心發(fā)酵液樣液的光吸收波長，對其色澤進行判斷并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 火龍果酒自然發(fā)酵與酵母發(fā)酵過程中酒精度的變化

在火龍果果汁中加入8%酵母培養(yǎng)液（V/V），果汁糖度調(diào)節(jié)到14%（M/V），25℃恒溫發(fā)酵，測量發(fā)酵10天的酒精度結(jié)果見下圖1:

圖1 不同發(fā)酵方法酒精度的變化Figure1 changes in alcohol accuracy in different fermentative methods

由圖1可知，在火龍果酒精發(fā)酵的過程中，隨著發(fā)酵的進行，處理組發(fā)酵液樣品的酒精度在不斷升高，在發(fā)酵的前4天酒精含量增加得較快，變化也比較明顯；自然接種發(fā)酵相對平緩，沒有處理組發(fā)酵快。從第7天開始，兩條線都逐漸趨于平緩，酒精度維持在8.5%-9%左右，說明發(fā)酵果汁中的糖分基本耗盡，酒精度的變化較小，生醇發(fā)酵趨于停止。

2.2 兩種發(fā)酵過程中的酵母總數(shù)變化

運用自然發(fā)酵與酵母發(fā)酵兩組實驗對比，在25℃恒溫發(fā)酵條件下，讓紅肉火龍果果汁進行酒精發(fā)酵，發(fā)酵第5天開始進行定時取樣、培養(yǎng)，測定酵母菌在發(fā)酵過程中的總數(shù)變化，通過對數(shù)據(jù)的處理、篩選，分別對第5,10,15,20，25,30,35天的酵母總數(shù)進行了分析，結(jié)果見圖2：

圖2 發(fā)酵后熟過程菌群的變化Figure2 changes of fermentation ripenling bacteria

由圖2可以看出，不管是酵母發(fā)酵還是自然發(fā)酵都是在第10-15天，酵母數(shù)量多，酵母的活力較高；從發(fā)酵第20天開始有在減少的趨勢，第25-35天酵母總數(shù)的變化不大，發(fā)酵逐漸趨于穩(wěn)定。

2.3 自然發(fā)酵與酵母發(fā)酵兩種火龍果酒的感官評定

果酒發(fā)酵結(jié)束后，在室溫條件下，選用誤差為（±1nm）的紫外-可見分光光度計測量得兩種發(fā)酵果酒樣品色素的光吸收波長都在400-700nm之間，同時在535nm處有一個單一的吸收峰出現(xiàn)，無其他雜峰的干擾，光吸收波長以峰值記錄，色澤上主要表現(xiàn)為棕紅，實驗的記錄如下表1：

表1 光吸收與感官評定Table1 linght absorption and sensory evaluation

2.4 游離氨基酸含量隨發(fā)酵時間的變化

不論自然發(fā)酵或酵母發(fā)酵，游離氨基酸有一個先下降后上升的趨勢，第1至4天氨基酸的含量快速下降，至第4、5天基本檢測不出，推測發(fā)酵前期酵母的繁殖需要一定量的氨基酸，后期隨著分解代謝的旺盛，游離氨基酸含量有所回升，結(jié)果見圖3。

圖3 游離氨基酸含量隨發(fā)酵時間的變化

2.5 總糖含量隨發(fā)酵時間的變化

酵母發(fā)酵和自然發(fā)酵條件下，總糖含量的變化趨勢相似。在其他條件不變下，隨著發(fā)酵時間的變化，還原糖的下降速度很快，可能是酵母菌生理代謝旺盛，因此糖的消耗加大。[7]總趨勢是總糖含量快速下降，而在第4d時糖量的增加，推測由于多糖分解代謝所致。如圖4所示。

圖4 總糖含量隨發(fā)酵時間的變化

2.6 總酸含量隨發(fā)酵時間的變化

紅肉火龍果在固定溫度25℃,含糖量調(diào)到15%的條件下通過自然發(fā)酵和酵母發(fā)酵兩種不同的發(fā)酵方式發(fā)酵，在發(fā)酵120h后可間隔24小時進行取樣，這時有明顯的發(fā)酵果酒香味，所得的總酸數(shù)據(jù)和時間得出下表，如圖5所示。

圖5 總酸含量隨發(fā)酵時間的變化

從圖5中可知，在其他條件不變時，自然發(fā)酵和酵母發(fā)酵下，隨著發(fā)酵時間的變化，總酸含量也在隨之增加，其中從1d到4d變化最為明顯，且自然發(fā)酵和酵母發(fā)酵兩種發(fā)酵條件下總酸含量變化趨勢相似。

2.7 酒精度隨發(fā)酵時間的變化

紅肉火龍果在固定溫度25℃,含糖量調(diào)到15%的條件下通過自然發(fā)酵和酵母發(fā)酵兩種不同的發(fā)酵方式發(fā)酵，在發(fā)酵120h后可間隔24小時進行取樣，這時有明顯的發(fā)酵果酒香味，所得的酒精度數(shù)據(jù)和時間得出下表，如圖6所示。

圖6 酒精度含量隨發(fā)酵時間的變化

由圖6可知，在其他條件不變的情況時，自然發(fā)酵和酵母發(fā)酵不同的發(fā)酵條件下，隨著發(fā)酵時間的變化，酒精度含量不斷增高，發(fā)酵時間在3d到6d時，酒精度含量變化最為明顯，到7d時，酒精度含量趨于穩(wěn)定，且酵母發(fā)酵的酒精度含量高于自然發(fā)酵的酒精度含量。

2.8 酵母菌種的鏡檢結(jié)果

酒精發(fā)酵主要產(chǎn)物是乙醇，在2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）實驗中，根據(jù)TTC顯色劑與酒精的顯色反應(yīng)對酵母產(chǎn)物進行顯色處理，TTC顯色劑遇酒精會顯示紅色，在酒精含量較高的培養(yǎng)基中會顯現(xiàn)為深紅色，酒精含量偏低的培養(yǎng)基中為淺紅色。由此，可以選擇深紅色的酵母菌落來進行培養(yǎng)、純化。用TTC培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選得到的酵母菌發(fā)酵能力較強、生長力旺盛、同時還有較好的同步性，在接種后能迅速的進入主發(fā)酵期，有利于發(fā)酵作用和提高產(chǎn)品的產(chǎn)量及口感。[9]純化過后得到的20株酵母菌都同時具有酵母菌典型菌落特征，將菌落劃線接種在PDA瓊脂斜面的培養(yǎng)基上。根據(jù)不同酵母菌落形態(tài)的特征、顏色、形態(tài)以及典型氣味可分為[10]3大類，記錄如下表2：

表2 鏡檢酵母細胞形態(tài)Table 2 microscopic examination of yeast cell morphology

3 結(jié)論與討論

3.1 本試驗以新鮮火龍果果實為原材料,經(jīng)過破碎榨汁,進行酒精發(fā)酵結(jié)果表明，自然接種發(fā)酵與酵母接種發(fā)酵，在溫度為25℃的條件下，從發(fā)酵動態(tài)的觀察、酒精度及酵母總數(shù)的測定等方面的分析得出：自然接種發(fā)酵：果酒呈淺棕紅色，果香四溢，有明顯的火龍果香味鮮明透亮的酒體；酵母接種發(fā)酵：火龍果酒色澤棕紅，酒香與果香交織，酒體晶瑩透亮。自然接種發(fā)酵在前期的主發(fā)酵過程中會比酵母菌接種發(fā)酵慢，但兩種發(fā)酵方式在最終的酒精度上相差不大。在果酒發(fā)酵的后熟階段，酵母菌總數(shù)也沒有太大的差異，后期自然發(fā)酵甚至比酵母發(fā)酵的更多，但差異不顯著。

3.2 本試驗粗測的紅肉火龍果果酒成品酒精度為9%，總糖含量為20g/L，氨基酸含量為2g/L，總酸含量為15.6g/L。酵母發(fā)酵果酒中的氨基酸、總糖、總酸與自然發(fā)酵差別很小，只有酵母發(fā)酵的酒精度顯著高于自然發(fā)酵。通過控制好發(fā)酵條件，就可以獲得醇馥濃郁、風(fēng)味協(xié)調(diào)的優(yōu)質(zhì)火龍果果酒。